转基因表达HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞受体

目的通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)转基因表达,初步观察其结合活性。方法从HLA-A2阳性急性乙肝患者外周血中诱导、分选、克隆和扩增HBV抗原特异性CTL;提取细胞RNA,用RT-PCR、5'-RACE和OVER-LAP PCR等方法获取TCR的α和β链编码基因;构建TCR重组逆转录病毒,介导特异性TCR分别在人Jurkat T细胞和HLA-A2阳性健康人CD8 T淋巴细胞上表达。结果从1例HLA-A2阳性急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vβ配对,分别命名为α21β13、α15β13,包装的重组逆转录病毒滴度为(1.5～5.0)×105IU/mL,用针对目标TCR的特异性Vβ链抗体(抗Vβ13 TCR-PE)和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行免疫荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达:其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%～2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%～2.06%和1.05%～1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论通过逆转录病毒介导可以使HBV特异性CTL TCR获得转基因表达,具有结合HLA-A2限制性表位的活性。

慢性阻塞性肺病稳定期患者外周血Treg细胞与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的表达及意义

目的检测吸烟者及慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)/B7及Treg细胞的表达,观察免疫指标在COPD外周血中的变化及临床意义。方法选择8名健康志愿者为A组(正常对照组)、8名吸烟但肺功能正常者为B组、8名轻中度慢性阻塞性肺疾病患者为C组,收集3组研究对象的外周血标本,采用流式细胞术分析方法检测各组外周血单个核细胞CD11c^(+)树突状细胞(DCs)的比例、CD11c^(+)DCs表面CD80及CD86的表达,Treg细胞(CD4^(+)CD25^(+)FOXP3^(+))及CD4^(+)CD25^(+)CTLA4^(+)的表达。结果与A组比较,B组及C组的CD11^(+)DCs、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)表达均显著增多,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在Treg细胞表达上,与A组相比,B组及C组的Treg细胞减少(均P<0.05),而B组与C组间比较无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B组及C组的CTLA4^(+)细胞表达增多,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论吸烟者及COPD患者外周血中CTLA4/B7呈高表达,Treg细胞比例减少,提示吸烟所致免疫细胞异常可能参与COPD全身炎症进展过程。

基于酵母β-葡聚糖载体的口服OVA疫苗(WGP-OVA疫苗)诱导体液免疫及抗原特异性T细胞免疫反应

目的:探讨口服WGP-OVA疫苗对C57BL/6小鼠体液免疫及抗原特异性T细胞免疫的诱导作用。方法:分别连续给予C57BL/6小鼠口服PBS、WGP及WGP-OVA 17 d后,使用LEGENDplexTM多因子流式检测试剂盒检测给药后小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG3及IgM的含量;HE染色比较各组小鼠脾脏淋巴小结的大小。取小鼠腹股沟淋巴结(ILNs)制备单细胞悬液,流式细胞仪(FACS)检测淋巴结内F4/80+巨噬细胞及F4/80+SIINFEKL+巨噬细胞比例,分析WGP-OVA对巨噬细胞在ILNs内的浸润及抗原提呈情况;同时通过MHC Tetramer染色检测抗原特异性CD8+T细胞比例,明确WGP-OVA疫苗对T细胞免疫的诱导作用。结果:与PBS组相比,WGP-OVA能显著诱导IgG1、IgG2a、IgG3及IgM的分泌,增大脾脏内淋巴小结。此外,口服WGPOVA疫苗能促进F4/80+巨噬细胞向淋巴结浸润,诱导巨噬细胞对OVA的抗原提呈,同时增加淋巴结内OVA特异性CD8+CTLs的数量。结论:口服WGP-OVA疫苗能诱导C57BL/6小鼠体液免疫及抗原特异性T细胞免疫反应。

艾灸干预免疫抑制兔细胞毒性T淋巴细胞抗原-4的作用效应分析

目的:比较不同艾灸干预下免疫抑制兔细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)及程序性死亡受体1(PD-1)表达变化的异同。方法:20只大耳白兔随机分为空白组、模型组、艾条灸(MSM)组与隔药饼灸(HPM)组,每组5只,连续7 d腹腔注射环磷酰胺(CTX)诱导免疫抑制模型。造模成功后分别进行MSM与HPM干预,均为隔日灸,共治疗10次。治疗结束后麻醉白兔,取血清、肝脏与脾脏,ELISA检测血清中PD-1、PD-L1含量,免疫组化法检测肝组织PD-1含量,RT-qPCR检测肝、脾组织CTLA-4 mRNA含量。结果:HPM和MSM均可降低免疫抑制下PD-1及PD-L1水平,并可有效抑制脾脏CTLA-4和肝脏PD-1、CTLA-4水平升高,与免疫抑制模型组相比差异均存在统计学意义(P<0.05),且Pearson相关性检验表明肝组织中CTLA-4与PD-1呈显著正相关(r=0.7807,P<0.001)。结论:HPM可通过调控多个免疫抑制位点改善机体免疫功能。

血清组织多肽特异性抗原、中性粒细胞与淋巴细胞比值、白蛋白与球蛋白比值联合检测在乳头状肾细胞癌预后评估中的临床价值

目的评估血清组织多肽特异性抗原(TPS)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、白蛋白与球蛋白比值(AGR)联合检测对乳头状肾细胞癌预后预测的效果。方法回顾性分析2021年2月至2022年10月期间在周口市中医院接受治疗并完成18个月随访的130例乳头状肾细胞癌患者,将其作为观察组,同时选取同期130例健康体检者作为对照组。比较2组血清TPS、NLR、AGR水平,并分析观察组患者不同生存状态下这些指标的变化。结果观察组血清TPS、NLR均高于对照组,而AGR低于对照组(t=17.929,P<0.001;t=13.431,P<0.001;t=15.773,P<0.001)。死亡患者血清TPS、NLR均高于生存患者,而AGR低于生存患者(t=5.310,P<0.001;t=7.090,P<0.001;t=3.845,P<0.001)。血清TPS、NLR升高和AGR降低为乳头状肾细胞癌患者术后生存状态的独立影响因素(P=0.019;P<0.001;P<0.001)。TPS、NLR、AGR、3项联合预测乳头状肾细胞癌患者预后的曲线下面积分别为0.715、0.832、0.682、0.941。结论TPS、NLR、AGR联合检测对乳头状肾细胞癌患者的预后预测效能高,且患者高TPS、NLR与低AGR为患者预后的不利因素。

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3+ CD8+ T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a+ DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3+ CD8+ T细胞比例明显增高 ,提示CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。

结核特异性CD4^(+)HLA-G^(+)和CD4^(+)CD69^(+)T细胞对活动性肺结核诊断及疗效评估价值

结核病仍是我国乃至全球的重大公共卫生问题之一[1]。如何早期诊断并监测结核病疗效是控制结核病的主要挑战。痰培养、痰涂片阳性以及其转阴分别是诊断和监测抗结核疗效的实验室常用方法,但这些方法均存在灵敏度低、耗时长等缺点。因此,可快速、灵敏的代替方法亟需临床探寻。目前关于结核特异性生物标志物用于结核的诊断和疗效监测少有研究报道。

口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第1 30～2 1 3AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay- mVP1。将pDisplay -mVP1转染PK 1 5细胞,经3次G41 8加压筛选,并用RT- PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK 1 5 /pDisplay- mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比2 5∶1和5 0∶1时,CTL裂解活性分别达到42 . 84%±3 2. 1 %和61 . 94%±4 2. 8% ,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p <0 . 0 1 )。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。

肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞

目的:探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞(DC)体外经自体肝癌细胞抗原致敏后,对特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL) 的诱导作用. 方法:肝癌患者外周血经梯度密度离心法分离,获得DC前体细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM- CSF)和重组人白介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DC. 制备自体肝癌细胞抗原,体外脉冲DC,检测DC诱导自体T细胞增生能力及特异性CTL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性. 结果:经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能诱导较强的自体T 细胞增生,且能诱导特异性CTL,该CTL,对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对CT26细胞、BEL-7402细胞无明显的杀伤作用. 结论:肝癌患者外周血DC体外能诱导高效而特异的抗肝癌免疫,提示DC可能在肿瘤治疗及预防其复发与转移中发挥重要作用.

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物CalceinAM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究:不同浓度CalceinAM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。

Th1/Th2平衡、分化簇抗原28、可诱导共刺激分子、程序性死亡受体-1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4在急性冠脉综合征患者外周血中的表达

目的研究Th1/Th2及相关细胞因子、共信号分子分化簇抗原28(CD28)、可诱导共刺激分子(ICOS)、程序性死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在急性冠脉综合征(ACS)患者外周血中的表达,并探讨其是否参与ACS的发病机制。方法前瞻性选取2021年7月至2022年4月经中山大学附属第三医院粤东医院心血管内科诊断为ACS的120例患者作为研究对象,采用ACS不同亚型的诊断标准将其分为不稳定型心绞痛(UA)组、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)组、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)组,每组各40例。选取同时间段行冠状动脉造影检查正常的40例住院患者作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中的干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-2、IL-4和IL-10表达水平,采用流式细胞仪检测外周血互助性T细胞(Th)1、Th2细胞占CD4^(+)T细胞的比例以及共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在CD4^(+)T细胞表面的表达水平,通过冠脉造影手术采用SYNTAX评分法评估ACS患者冠脉病变严重程度,比较四组上述各指标之间的差异并进行各指标之间的相关性分析。结果ACS患者外周血中Th1/Th2比值、Th1数量及相关细胞因子IFN-γ和IL-2的血清表达量高于对照组,其外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达量也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,STEMI组和NSTEMI组的这些指标也均高于UA组,差异有统计学意义(P<0.05);SYNTAX评分与外周血Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2水平和外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量呈明显正相关(P<0.05);外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量均与Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2表达水平呈明显正相关(P<0.05)。结论ACS患者外周血中的Th1、相关细胞因子IFN-γ和IL-2以及其CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达较健康体检者均明显上调,其均可能在ACS的发病机制中发挥了重要作用。

分子伴侣Tapasin在介导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应中的作用

病毒及肿瘤细胞的清除很大程度上依赖于特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL),CTL通过T细胞受体(TCR)特异性识别病毒肽段并通过MHC-I类分子提呈引起感染细胞融解,经典MHC-I类分子在内质网内的装配要求有抗原肽配体和β2微球蛋白(β2m)的存在,而这一过程需要伴侣分子(chaperones)如Tapasin的参与。Tapasin是抗原递呈相关转运体(TAP)相关蛋白的基因产物,与MHC-I类分子同为免疫球蛋白超家族成员,在介导特异性CTL反应中有着重要作用,本文简述了Tapasin分子结构特征、在介导特异性CTL反应中的作用及与疾病的联系。

妊娠期特异性beta1糖蛋白9 HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的:鉴定来自食管癌细胞中特异性高表达的妊娠期特异性beta1糖蛋白9(PSG9)的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法:首先运用RT-PCR方法检测PSG9mRNA在食管癌细胞EC9706、EC-1及EC-109中的表达情况。然后通过Bimas和Syfpeithi预测,再结合NetCTL1.2选取4条来源于PSG9的HLA-A3限制性的表位。候选表位P336的2位的氨基酸由异亮氨酸替换为亮氨酸,9位的氨基酸由酪氨酸替换为赖氨酸。候选表位P378的9位氨基酸由精氨酸替换为赖氨酸。候选表位通过标准的Fmoc化学法合成,通过结合力实验检测表位与T2A3细胞表面HLA-A3分子的结合力水平,通过细胞毒实验检测对EC-1细胞毒活性。结果:PSG9在肿瘤细胞EC9706、EC-1以及EC-109中都有表达。候选表位P107、P201和P336-2L9K与HLA-A3分子有弱结合力,P336、P378和P378-9K与HLA-A3分子有中等结合力。细胞毒实验结果显示P336-2L9K、P378和P378-9K对EC-1细胞均有一定的杀伤作用。结论:多肽P336-2L9K、P378和P378-9K能诱导体外抗肿瘤免疫反应,有可能成为PSG9阳性肿瘤细胞的共同CTL表位。

自然杀伤细胞和神经元特异性烯醇化酶及T淋巴细胞亚群在新生儿化脓性脑膜炎外周血中的表达及临床意义

目的探讨自然杀伤细胞(NK)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))在新生儿化脓性脑膜炎外周血中的表达及临床意义。方法选取2021年10月至2022年12月赣州市妇幼保健院收治的30例化脓性脑膜炎患儿作为观察组,另选取30名同期出生的健康新生儿作为对照组。两组于入组后次日清晨采集空腹静脉血,观察组治疗后10 d再次采集空腹静脉血。比较两组外周血NK、NSE与T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))水平。结果治疗前,观察组NK、CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组NK、CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),但与对照组比较差异无统计学意义。治疗前,观察组NSE水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组NSE水平低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),但与对照组比较差异无统计学意义。ROC曲线分析结果显示,NK诊断价值最高,其次为CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、NSE、CD4^(+)和CD8^(+)。结论新生儿一旦罹患化脓性脑膜炎,会导致外周血中T淋巴细胞紊乱失调,T淋巴细胞免疫功能长时间处于抑制状态,促使脑神经受到不同程度损伤,而通过观察NK细胞、NSE及CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)在外周血中的表达,可为临床诊疗提供有力的参考依据,从而改善其免疫功能,有效控制病情,促进患儿病情康复。

丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的研究

目的研究慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能及其与临床疾病状态的关系。方法表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core通过Lipofecta-mineTM基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞(Hep-core),经Western blot证实有HCV核心蛋白表达;分离患者外周血单个核细胞,经体外诱导扩增获得HCV特异性CTL(HCV-CTL),以Hep-Core细胞和HepG2细胞作靶细胞,乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL活性,用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ)含量,以正常人作为对照。结果慢性丙型肝炎患者组HCV-CTL活性值为(23.9±4.8)%,明显低于对照组(42.6±6.5)%(t=7.22,P=0.011)。高病毒载量组HCV-CTL活性值(18.9±4.8)%,明显低于低病毒载量组的(33.7±3.2)%(t=8.22,P=0.003);基因1型患者HCV-CTL活性值(20.8±2.1)%明显低于基因2或3型的(32.4±2.5)%(t=11.7,P=0.001);ALT升高患者HCV-CTL活性值(29.3±3.1)%与ALT正常患者(25.7±3.4)%相比无统计学差异(t=0.93,P>0.05)。慢性丙型肝炎患者培养上清液中的IFN-γ量(957±241)pg/ml明显低于对照组的(3117±673)pg/ml(t=8.87,P=0.001)。结论慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低,CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型相关而与ALT水平无关。

受体T淋巴细胞克隆的建立及其抗原特异性的检测

目的 建立受体T淋巴细胞克隆后 ,进一步分析检测该克隆针对供体的抗原特异性。方法 供体鼠脾细胞免疫受体鼠 ,再分离、纯化受体鼠T细胞 ,克隆受体T细胞。将动物分组免疫 ,对各组受体作电镜观察淋巴细胞超微结构、MTT法测定淋巴细胞增生试验以及流式细胞分析T细胞亚群的变化 ,分析检测该克隆针对供体的抗原特异性。结果 ①受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆稳定建立 ;②经免疫组的受体T细胞超微结构改变显著 ,淋巴细胞增生试验及流式细胞分析结果与对照组的差异有显著性意义 (t>t0 0 5)。结论 成熟T淋巴细胞 ,在一定条件下仍可发生分裂和增生 ,形成克隆。通过供体脾细胞抗原特异性刺激 。

EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞体外诱导培养及杀伤效果鉴定

本研究旨在探讨EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)体外诱导和扩增培养的方法,并检测其特异性杀伤的效果。采集EBV血清抗体阳性的6例正常供体的外周血单个核细胞(PBMNC),用EBV转化的B淋巴细胞系(BLCL)作为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经辐照灭活后不断刺激培养自体PBMNC,诱导产生EBV-CTL,并将其扩增培养;采用流式细胞仪鉴定其免疫表型,然后检测不同效靶细胞比例条件下EBV-CTL对自体BLCL(autoBLCL)、自体植物血凝素培养的B淋巴母细胞(PHA-blast)、HLA不合供体的BLCL(alloBLCL)、K562细胞株的杀伤效果。结果表明,6例EBV血清抗体阳性正常供体来源的PBMNC在体外成功筛选并扩增培养了EBV-CTL,扩增效率为PBMNC数的18.6-55.0倍。刺激10次培养后的EBV-CTL对autoBLCL在20∶1、10∶1、5∶1三种效靶细胞比例条件下特异性杀伤效率的平均值分别为59.4%、43.2%、29.0%;对PHA-blast、alloBLCL、K562的非特异性杀伤率在上述三种效靶细胞比例下平均值依次为7.1%、9.4%、10.3%(P<0.05),6.6%、8.3%、8.1%(P<0.05),5.4%、7.3%、6.3%(P<0.05)。结论:EBV-CTL能有效在体外筛选培养并扩增,并能有效杀伤HLA相合的BLCL,可望成为EBV相关性移植后淋巴细胞增殖性疾病的过继免疫治疗的有效方法。

人工抗原呈递细胞复合物体外诱导特异性T淋巴细胞活化的研究

本研究旨在以人工抗原呈递细胞(artificial antigen-presenting cells,aAPCs)体外模拟树突状细胞生物学功能,探讨诱导特异性T淋巴细胞活化、增殖的作用。以磁性微珠为载体,选取慢性髓系白血病特异性抗原CML28作为目标抗原肽,通过抗原表位预测软件获取CML28表位序列(Vltfaedsv),并以该抗原表位与MHC分子(HLA-A2-Ig)偶联,作为第一信号分子,B7-1分子作为第二信号分子,将两种信号分子同时负载于磁珠表面,构建人工APC复合体;取HLA-A2+的健康骨髓捐赠者骨髓单个核细胞,以磁珠分选出CD8+T淋巴细胞并与人工APC复合体系统共培养。培养过程中加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxylfluorescin diacetate succinimidylester,CFSE),并以此检测T细胞增殖,用流式细胞仪检测特异性T细胞增殖程度。结果发现:实验组中CML28-特异性T细胞增殖程度明显增高,实验组平均值为(17.34±0.35)%,对照组平均值为(2.25±0.43)%,两者比较差异显著(p<0.01)。结论:人工APC复合体系统在体外能模拟人体抗原呈递细胞,刺激CD8+T特异性淋巴细胞活化、增殖。

活化B淋巴细胞诱导健康人外周血HBcAg短肽特异性细胞毒性T淋巴细胞

目的探讨负载乙型肝炎病毒核心抗原18-27(HBcAg 18-27)序列肽的活化B淋巴细胞诱导自体外周血单个核细胞(PBMC)产生HBcAg 18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。方法免疫磁珠法分选B淋巴细胞,与CpG寡核苷酸(CpG-ODN)(2μg/mL)和白细胞介素-4(IL-4)(2 ng/mL)共培养48 h,再加入人工合成的HBcAg 18-27肽(50μg/mL),继续温育12 h。将负载抗原肽的活化B淋巴细胞与自体PBMC进行混合淋巴细胞培养5 d,采用Pro5TMMHC Pentam ers技术检测HBcAg 18-27特异性CTL。结果免疫磁珠法分选B淋巴细胞纯度为89.60%。荧光显微镜观察到HBcAg 18-27抗原肽进入活化B细胞,流式细胞仪定量检测抗原负载率为41.3%。以此作为HBcAg 18-27特异性抗原递呈细胞(APC)能够从自体PBMC中诱导出HBcAg 18-27特异性CTL。对照组(不加APC)HBcAg 18-27特异性CTL为(0.20±0.10)%,实验组(加APC)为(0.50±0.19)%,2组差异有统计学意义(P<0.01)。结论负载了HBcAg 18-27肽的活化B淋巴细胞能够诱导自体PBMC产生HBcAg 18-27特异性CTL。

负载食管癌抗原肽树突状细胞诱导的T淋巴细胞对食管癌细胞的特异性杀伤活性

目的研究负载食管癌抗原肽树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)对人食管癌细胞株 TE-1的杀伤效应。方法用弱酸洗涤法获得食管癌 TE-1细胞的抗原肽,体外诱导扩增 DC 并负载酸洗食管癌抗原肽,用负载该抗原肽的 DC 制备特异性 CTL,以^(51)Cr 释放法测定 CTL对 TE-1细胞的杀伤活性。结果负载酸洗食管癌抗原肽 DC 诱导的 CTL 对 TE-1细胞的杀伤率[(81.12±2.93)%]较未负载食管癌抗原肽 DC 诱导的 CTL 对 TE-1的杀伤率[(11.16±3.07)%]明显提高,差异有统计学意义(F=2437.09,P<0.001)。负载食管癌抗原肽 DC 诱导的 CTL 对用干扰素(IFN)-γ刺激后的 TE-1细胞杀伤率[(89.15±3.62)%]比未经 IFN-γ刺激的 TE-1细胞杀伤率[(61.19±5.17)%]高,对酸洗后 TE-1的杀伤率[(9.18±2.52)%]明显减低,组间差异有统计学意义(F=963.43,P<0.001)。负载食管癌抗原肽 DC 诱导的 CTL 对人食管癌细胞株 TE-1、Eca-109,人肺腺癌细胞株 K59和人肾透明细胞癌细胞株786-0的杀伤率依次减低,差异有统计学意义(F=680.87,P<0.001)。结论以 DC 为提呈细胞的肿瘤免疫治疗有望成为有效治疗食管癌的新途径。