人黑色素瘤相关抗原基因-12基因疫苗对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及体内抗体水平的影响

目的:研究人黑色素瘤相关抗原基因-12(MAGE-12)基因疫苗pEGFP-C3-MAGE-12对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及体内抗体水平的影响。方法:小鼠80只,随机分为4组,每组20只。疫苗组、空质粒组和生理盐水(NS)组接种Lewis肺癌瘤组织制备Lewis肺癌小鼠模型。接种癌组织前14d、7d、0d,疫苗组按每次每只0.2mL(75ng/L)于右下肢内侧肌肉群内注射pEGFP-C3-MAGE-12;空质粒组和NS组每只每次注入pEGFP-C3空质粒或NS;空白对照组小鼠不做任何处理。每3d观察并记录1次肿瘤大小。接种瘤组织后14d每组取10只小鼠,ELISA法检测血清MAGE-12-Ab,余小鼠(每组10只)自然死亡,记录生存时间。结果:3组7d成瘤率均为100%。空质粒组、NS组及疫苗组生存期分别为(27.0±0.3)d,(27.2±0.3)d和(28.9±0.6)d;肿瘤体积分别为(179.775±9.085)mm3,(173.172±9.085)mm3和(144.923±9.528)mm3;疫苗组血清MAGE-12-Ab水平为(711.16±174.78),其他3组未检测到MAGE-12-Ab;与空质粒组、NS组比较,疫苗组生存期短(P<0.05),肿瘤体积小(P<0.05),体内抗体水平高(P<0.05)。结论:MAGE-12基因疫苗具有免疫治疗作用。

卵巢上皮性癌相关抗原基因FXR1的表达及其临床价值

目的：探讨FXR1基因在卵巢上皮性癌中的表达及其临床价值。方法：用RT-PCR法检测FXR1基因在36例卵巢上皮性癌、15例卵巢良性肿瘤、13例正常卵巢组织中的表达。结果：FXR1基因在卵巢上皮性癌（0.915±0.6883）、良性肿瘤（0.5778±0.4785）、正常组织（0.2855±0.2335）中均有一定程度表达。癌组织中的相对表达水平高于良性卵巢肿瘤,但差异无统计学意义（P〉0.05）;癌组织中的FXR1基因相对表达水平高于正常组织（P〈0.05）;良性卵巢肿瘤组织中的相对表达水平高于正常卵巢组织（P〈0.05）;手术—病理分期为Ⅰ-Ⅱ期癌组织中的FXR1基因相对表达水平低于Ⅲ期（P〈0.05）;高分化癌组织中的FXR1基因相对表达水平低于中—低分化癌组织（P〈0.05）。结论：FXR1基因的表达可能与卵巢上皮性癌相关,可能在卵巢上皮性癌的发生、发展过程中起一定作用。

黑色素瘤相关性抗原E1基因的克隆与测序

目的 克隆表达人黑色素瘤相关性抗原MAGE E1片段 ,以便研究其对神经系统恶性肿瘤的生物学作用。方法 从人胶质瘤细胞系BT 32 5中提取mRNA ,用RT PCR法从中扩增出MAGE E1片段 ,采用DNA重组技术将其克隆于 pGEM TEasy载体中并测序。 结果 RNA体外扩增得到的片段为 4 0 0bp ,PGEM MAGE E1经酶切鉴定正确 ,测序结果与Genebank比较完全相同。

抗原处理相关运载体等位基因与I型糖尿病的关联研究

目的 :探讨抗原处理相关运载体 (transporterassociatedwithantigenprocessing ,TAP)等位基因与I型糖尿病 (DM1)的关联性。方法 :用聚合酶链反应 序列特异性寡核苷酸探针杂交技术 ,对 5 2例DM1患者及 6 1例正常对照人群进行TAP1、TAP2等位基因变异位点氨基酸表型频率分析。结果 :DM1患者TAP1333位Ile Ile、6 37位Asp Asp、TAP2 379位Val Val纯合子表型频率显著低于对照 (P <0 0 0 5 ) ,DM1患者TAP1333位Ile Val、6 37位Asp Gly、TAP2 379位Ile Val杂合子表型频率明显高于对照 (P <0 0 0 5 )。TAP基因的其它变异位点氨基酸表型频率在DM1患者与正常对照组之间的差异无显著性意义。结论 :TAP1333位Ile Ile、6 37位Asp Asp、TAP2 379位Val Val纯合子表型可能是DM1的保护基因。TAP1333位Ile Val、6 37位Asp Gly、TAP2 379位Ile

细胞毒性淋巴细胞相关抗原4基因多态性与宁夏地区Graves病的相关性研究

目的分析细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)启动子318C/T位点基因多态性与宁夏地区Graves病(Graves'disease,GD)相关性。方法提取61例宁夏地区GD患者和79例正常对照组的外周血白细胞基因组DNA,应用PCR-RFLP技术检测CTLA-4启动子(318)位点C318T的多态性。结果GD组与正常对照组CTLA-4 C318TCC、CT、TT三种基因型分布(χ2=1.80,P=0.18)和等位基因频率(χ2=1.04,P=0.31)差异无统计学意义。结论CTLA-4基因SNP-(318)C/T位点可能不是宁夏地区GD的易感基因。

人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究

本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT0 4agcDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨。采用 5 RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA ,借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析 ,以细胞生长曲线、FCM分析及RT PCR技术分别观察重组ALT0 4ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达。结果表明ALT0 4agcDNA序列全长 1115bp ,含有编码 194个氨基酸的开放阅读框架 ,计算预测其分子量为 2 1KD ,等电点为5 5 1。该序列登录Genbank(AF0 2 6 816 )时未发现同源序列 (2 0 0 1 1 30 )。该基因转染的细胞有ALT0 4ag基因表达 ,ALT0 4ag基因表达可上调c myc基因表达及加速细胞增殖速率 ,但对bcl 2及p5 3基因表达无影响 ,提示ALT0 4ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一。

肿瘤相关抗原线粒体蛋白12基因的RNA干扰对HeLa细胞的抑制作用

目的:探讨肿瘤相关抗原线粒体蛋白质12基因(tumor-associated antigen mitochondrial protein 12 gene,TAMP12)表达变化对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用。方法:利用计算机辅助设计并化学合成3对针对TAMP12的siRNA片段,通过脂质体法将siRNA转染于TAMP12高表达的HeLa细胞中,筛选有效的siRNA片段。以RT-PCR、实时定量PCR及流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞TAMP12 mRNA及蛋白表达的变化。以激光扫描共聚焦显微镜(confocal lyser scarning microscope,CLSM)观察双色荧光标记蛋白的亚细胞定位和定量表达。以3H-TdR掺入实验和FCM检测阻断TAMP12基因表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。结果:CLSM检测显示TAMP12蛋白主要表达在HeLa细胞线粒体中。转染siRNA-TAMP12的肿瘤细胞中TAMP12 mRNA及蛋白的表达显著降低,与对照组对比,抑制率分别为81%和87%(P<0.01);转染细胞的DNA合成受抑制,抑制率达42%(P<0.01);转染siRNA-TAMP12肿瘤细胞的凋亡率由对照细胞的8.14%上升到15.59%(P<0.01)。结论:RNA干扰可阻断TAMP12基因的表达,从而对人宫颈癌Hela细胞产生抑制作用。

舌鳞癌抗原提呈相关基因表达的研究

目的:分析舌鳞状细胞癌组织中抗原提呈相关基因的表达。方法:选取2008年12月～2009年12月在南京市口腔医院口腔颌面外科就诊的30例原发舌癌患者的肿瘤及癌旁组织标本,采用实时定量PCR检测TAP-1和Tapasin的mRNA相对表达量,同时检测正常黏膜角化上皮细胞及舌鳞癌细胞系中TAP-1和Tapasin的表达。结果:与癌旁组织相比,肿瘤标本中TAP-1和Tapasin的表达显著下降,并且其mRNA表达水平与肿瘤的病理分级有显著相关性(P=0.001)。与正常口腔黏膜上皮细胞相比,肿瘤细胞中TAP-1和Tapasin的表达亦呈明显降低。结论:舌鳞癌中TAP-1和Tapasin的表达明显降低,可能是导致肿瘤发生免疫逃逸的机制之一。

精子相关抗原6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征细胞凋亡

目的研究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)基因是否以P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞凋亡。方法通过P53kd RNA慢病毒转染人结肠癌细胞株HCT116筛选P53基因沉默的最佳靶点,利用筛选出来的最佳靶点序列转染SKM-1细胞;加入嘌呤霉素提高转染效率,RT-PCR及Western blot检验P53基因的干扰效果,构建SKM-1 P53kd细胞模型。用SPAG6kdRNA慢病毒载体转染SKM-1和SKM-1 P53kd细胞,RT-PCR及Western blot验证。用CCK-8法检测重组人可溶性TRAIL蛋白(r TRAIL)对SKM-1细胞的适宜作用浓度。Western blot检测r TRAIL处理后SKM-1和SKM-1 P53kd细胞株中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平。结果构建了SKM-1 P53kd细胞模型,转染率在90%以上,P53基因在mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著降低(P<0.01)。SPAG6kdRNA慢病毒载体成功感染SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞,转染率均在80%以上,SPAG6基因表达较对照组明显降低(P<0.01)。随着r TRAIL浓度的增加,细胞生长逐渐被抑制,30 ng/m L TRAIL诱导的细胞凋亡与对照组差异没有统计学意义,100 ng/m L和300 ng/m L TRAIL显著诱导SPAG6kd细胞凋亡(P<0.05),而P53基因沉默与否并没有影响该结果,r TRAIL处理后细胞凋亡标志分子明显激活或水平升高,细胞中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平在SKM-1和SKM-1 P53kd细胞中差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SPAG6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡。

立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原的免疫印迹分析

目的表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)主要抗原基因,免疫印迹初步分析重组蛋白抗原的抗原性。方法根据立氏立克次体全基因组序列选出主要抗原相关基因,采用PCR从全基因组中扩增抗原相关基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒构建抗原基因重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌并诱导转化菌表达重组蛋白抗原。采用立氏立克次体感染的豚鼠血清和斑点热患者血清分别与纯化的重组蛋白抗原做免疫印迹分析。结果经PCR扩增后获得43个目的基因片段,其中36个基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白抗原,其中5个蛋白抗原在免疫印迹中与感染豚鼠血清和斑点热患者血清反应均为阳性。结论免疫印迹筛选出5种立氏立克次体重组蛋白抗原,结果提示它们是能够诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗原,可作研制斑点热诊断试剂或亚单位疫苗的新候选蛋白抗原。

大黄鱼肝细胞肿瘤相关抗原-127基因克隆及分子特征分析

在构建大黄鱼肌肉组织cDNA文库的基础上,克隆了肝细胞肿瘤相关抗原-127基因。克隆到的基因全长1 439bp,其中5'-UTR 124 bp,3'-UTR 640 bp,编码序列675 bp,编码224个氨基酸。生物信息学分析显示,大黄鱼HCA127基因存在多个功能位点,即N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和亮氨酸拉链结构位点。大黄鱼HCA127氨基酸序列具有较高的保守性,与斑马鱼、胡瓜鱼、大西洋鲑等多种鱼类的相似性在80%以上。在检测的9种组织中,肝细胞肿瘤相关抗原-127基因在肝、肾、肠、鳃、眼、脑组织中表达,其中在脑组织中表达最强,肝和鳃组织中次之,肾和眼组织中表达较微弱。

中国人CTLA-4基因-1722位点多态性与系统性红斑狼疮的相关性

目的研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4)基因启动子区-1722位点(T/C)多态性在中国南方地区汉族人群中的分布及其与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性。方法103例患者诊断均符合1982年美国风湿病学会修订的SLE分类标准,其中男13例,女90例。正常对照组110例,其中男21例,女89例。全部研究对象均为无血缘关系的中国南方汉族人群。采用微量全血提取法,从EDTA抗凝血中提取DNA。应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法,对所有SLE患者和正常对照者进行CTLA-4基因-1722位点多态性检测。结果CTLA-4基因-1722位点多态性在中国南方地区人群中普遍存在,与正常对照组比较,SLE患者CTLA-4基因-1722位点TC基因型频率明显升高(42% vs58%,P<0.05), CC基因型频率明显降低(25% vs15%,P<0.05),TT基因型频率虽有降低趋势,但差异无显著性(33% vs27%,P>0.05);而SLE患者等位基因频率和携带者频率分布均无显著性差异(P>0.05)。在不同人种CTLA-4基因-1722位点基因型频率和等位基因频率分布存在差异。结论CTLA-4基因-1722位点多态性与SLE明显相关,CTLA-4基因可能是SLE的易感基因。

广东人汉族群CTLA-4基因外显子1多态性与Graves病的相关性

目的探讨CTLA-4基因外显子1多态性与广东地区汉族人群Graves病的关系。方法以PCR-RFLP技术观察100名健康人与100例Graves病(GD)患者细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因外显子1的多态性。结果提示GD患者的CTLA-4外显子1的G49等位基因频率较正常对照组显著增高(P<0.01)。结论CTLA-4基因可能是广东地区汉族人群中GD的易感候选基因。

LMP7、TAP2基因多态性与云南汉族非小细胞肺癌的相关性

目的:探讨低相对分子量蛋白酶体7基因(LMP 7)及抗原处理相关转运体2基因(TAP 2)中的单核苷酸多态性(SNP)与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性。方法:选取云南汉族非小细胞肺癌患者467例作为病例组、同期健康正常人群488例作为对照组,采用Taq Man探针基因分型方法对TAP2基因的SNP位点rs241447及LMP7基因的SNP位点rs2071543进行基因分型,分析rs241447和rs2071543等位基因和基因型在病例组和对照组间的分布差异,分析这两个SNP位点在肺癌不同临床分期的中分布差异。结果:rs241447在对照组和病例组中基因型的分布频率比较,差异有统计学意义(P=0.015);在超显性遗传模式下,rs241447基因型C/C-T/T可能是云南汉族人群非小细胞肺癌的风险因素(OR=1.38,95%CI为1.07~1.78,P=0.014),rs2071543的等位基因和基因型在对照组和病例组中的分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TAP2基因中的SNP位点rs241447可能与云南汉族人群非小细胞肺癌的易感性相关。

负载MAGE-A3抗原的树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响

目的:探究负载黑色素瘤相关抗原基因A3(MAGE-A3)的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响。方法:采集人外周血分离单个核细胞,利用细胞因子分别诱导生成DC和CIK;MAGE-A3孵育DC后与CIK共培养,流式细胞仪检测DC-CIK、MAGE-A3-DC-CIK的表型;流式细胞仪分选子宫内膜癌细胞系Ishikawa的CD133^(+)干细胞,以子宫内膜癌干细胞作为靶细胞,分别以CIK、DC-CIK及MAGE-A3-DC-CIK作为效应细胞,MTT法检测效靶比为10∶1、20∶1、40∶1的细胞杀伤活性,ELISA法检测联合培养细胞上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17水平,Annexin V-FITC/PI双染法检测子宫内膜癌干细胞凋亡;建立子宫内膜癌干细胞移植瘤裸鼠模型,尾静脉注射DC-CIK或MAGE-A3-DC-CIK,观察裸鼠肿瘤生长情况,每隔2 d测量瘤体大小,21 d后取肿瘤组织,电子天平称重,HE染色观察肿瘤组织病理形态学变化,免疫组织化学染色检测肿瘤组织内Ki-67表达。结果:分离获得细胞表面CD80、CD86、HLA-DR表达分别达到88%、86%和90%的DC;MAGE-A3-DC-CIK组细胞表面CD8^(+)CD3^(+)、CD56^(+)CD3^(+)比例均高于DC-CIK组(P<0.01);经磁珠分选后获得CD133^(+)细胞比例高达90.23%的子宫内膜癌干细胞;与CIK组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组在不同效靶比下对子宫内膜癌干细胞的杀伤能力升高,细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-12及IL-17的分泌水平升高,培养液上清处理的子宫内膜癌干细胞凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01);同时,与对照组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组移植瘤裸鼠的肿瘤体积小,肿瘤重量轻,肿瘤组织内细胞稀疏,Ki-67阳性细胞率减小,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:负载MAGE-A3的DC与CIK联合培养能促进CIK成熟,提高对子宫内膜癌干细胞的杀伤性,并抑制移植瘤裸鼠的恶性进展。

采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1

c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是快速获得新基因 5′和 3′端未知序列的有效手段 .鉴于新报导的人肿瘤基因 MAGE家族成员之一 MAGE- D1的 c DNA序列不完全 ,从而拟用 RACE技术获得 MAGE- D1的全长 c DNA序列 .结果显示 ,MAGE- D1的 c DNA全长为 2 80 0个碱基 ,编码778个氨基酸 .同时对 RACE技术应用时的一些关键问题进行了讨论 .

上海人群中TAP、LMP和HLA-DM基因多态性研究

调查上海人群中抗原处理相关基因TAP、LMP和HLA-DM的分布情况,并探索这些基因与自身免疫病类风湿关节炎(RA)、IgA肾炎(IgAN)和多发性硬化症(MS)的可能关联。应用PCR-SSO或PCR-RFLP技术对80名无血缘关系的上海地区正常人及156名RA患者、60名IgAN患者和21名MS患者作了TAP1、TAP2、LMP2、HLA-DMA和HLA-DMB基因分型。并作了两位点连锁不平衡分析。在该群体中,(1)共观察到4个TAP1、6个TAP2、2个LMP2、4个HLA-DMA和4个HLA-DMB等位基因;(2)在TAP1B-TAP2A、TAP1B-LMP2H和TAP2D-DMA*0101存在连锁不平衡(Pc<0.05);(3)本人群中IgAN和MS的遗传易感性与抗原处理相关基因无关,而RA患者中DMB*0101基因频率降低(P<0.01),TAP1C和DMB*0104等位基因频率显著升高(P<0.01)。比较分析表明,上海人群中抗原处理相关基因多态性与国外其他人种中的报道相似,本人群中IgAN和MS与抗原处理相关基因不关联,而TAP1C和DMB*0104等位基因可能是RA的遗传易感基因。

MAGE－A基因亚家族及其在肿瘤临床上的应用前景

黑素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)-A基因亚家族属于癌睾丸抗原家族,其定位于X染色体,包括MAGE-A1～MAGE-A12共12个成员。对MAGE-A在基因和蛋白水平的研究发现,其在正常组织中几乎不表达,而在多种肿瘤组织中均有较高水平的表达,并且往往表达一种以上的MAGE-A亚型。正常情况下,由于CpG岛高度甲基化,MAGE-A基因沉默表达。受辐射等因素影响时,基因组易发生去甲基化,促使MAGE-A基因表达。组蛋白的乙酰化也与MAGE-A的表达有关。MAGE-A作为肿瘤相关抗原,与肿瘤的发生、发展、耐药及较差的预后密切相关。由于MAGE-A特异性的表达于多种肿瘤,对MAGE-A亚型的检测尤其是多种亚型的联合检测有助于MAGE-A阳性肿瘤的诊断。此外,MAGE-A基因编码的抗原肽由MHCⅠ分子提呈至细胞毒性T细胞,从而发挥抗肿瘤活性。应用MAGE-A抗原肽的肿瘤疫苗已经投入临床试验,并取得了良好的治疗效果。

MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞治疗小鼠乳腺癌移植瘤

目的研究黑色素瘤相关抗原基因A3(MAGE-A3)抗原肽负载树突状细胞(DCs),在乳腺癌动物模型免疫治疗中的作用。方法采用MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞,过继免疫治疗乳腺癌的小鼠模型,观察其治疗效果。结果抗原负载的DCs治疗组的生存率(100%)、抑瘤率(76·3%)明显高于对照组(P<0·05);肿瘤转移率(22·2%)低于对照组(P<0·05)。同时,治疗组的小鼠生存质量高于对照组。结论MAGE-A3抗原肽负载DCs疫苗是一种比较安全有效的治疗方法。

MAGEA12在胃肠道间质瘤中的表达及其与危险度分级的关系

目的:探讨胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)中黑色素瘤相关抗原基因A12(melanomaassociated antigen gene A12,MAGEA12)的表达水平及其与GIST危险度分级的关系。方法:收集5例GIST患者的肿瘤组织及癌旁组织,采用转录组测序的方法,通过主成分分析(principal components analysis,PCA)、基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)及差异表达基因分析法,明确GIST组织异常信号通路及异常表达基因;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法验证90对GIST组织中异常表达基因MAGEA12的表达水平,并通过χ2检验分析MAGEA12的表达水平与GIST患者临床病理特征的相关性。结果:PCA显示GIST组织基因表达谱与癌旁组织比较差异有统计学意义;GSEA发现,GIST组织中多种肿瘤相关信号通路异常高表达;差异表达基因分析发现,MAGEA12是GIST组织中表达上调最高的基因(表达升高25倍);qRT-PCR验证了MAGEA12在GIST样本中显著高表达,且与GIST危险度分级呈正相关。结论:MAGEA12在GIST中高表达,其表达水平与GIST危险度相关,可能成为治疗的新靶点。