鸭抗原相关转运体TAP1和TAP2原核表达及多克隆抗体的制备

HBK鸭是国家禽类实验动物种子中心培育的我国首个无特定病原体(SPF)鸭,已封闭饲养9个世代。鸭抗原处理相关转运体(TAP)基因位于主要组织相容性复合体区域,TAP1和TAP2组成的二聚体具有将抗原肽从细胞质转运入内质网腔的重要作用。为了表达鸭抗原相关转运体蛋白,并制备特异性多克隆抗体,试验采用PCR方法扩增HBKB系鸭的TAP1完整基因和TAP2基因的预测肽结合区(PBD),分别命名为TAP1和TAP2PBD,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒p ET-TAP1和p ET-TAP2PBD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDSPAGE及Western-blot鉴定,表达产物经SDS-PAGE后分别切胶免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明:两种目的蛋白均获得了正确表达。说明试验制备了高特异性鸭TAP1和TAP2多克隆抗体,可用于水禽TAP的结构和功能研究。

抗原处理相关转运体1和主要组织相容性复合体-I类分子在尖锐湿疣皮损中的表达及相互关系探讨

目的:研究抗原处理相关转运体(TAP)1和主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子在尖锐湿疣(CA)皮损中的表达情况及其相互关系,探讨在尖锐湿疣患者中是否存在MHC-I类抗原提呈途径的缺陷。方法:采用免疫组化法检测30例CA患者皮损和10名正常人包皮组织中TAP1和MHC-I类分子的表达。结果:①与正常包皮对照组相比,CA皮损中TAP1和MHC-I类分子表达水平均显著降低。②在CA皮损中TAP1和MHC-I类分子的表达呈正相关。结论:CA患者皮损中TAP1和MHC-I类分子表达降低,MHC-I类抗原提呈途径缺陷,这在人乳头瘤病毒逃逸机体免疫监视的过程中可能发挥着重要的作用。

抗原处理相关转运体(TAP)的结构和功能研究进展

抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族的B亚家族,是由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)上2个紧密连锁的基因TAP1和TAP2编码蛋白组成的异二聚体,位于内质网和顺式高尔基膜上,功能是将抗原肽从细胞质转运进入内质网池,组装到MHC I类分子上构成复合体。TAP蛋白的缺乏和突变会影响抗原肽的提呈,最终损害免疫应答功能。

主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单抗的制备

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于^(297)NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI^(322),对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。

抗原处理相关转运体基因多态性与疾病相关性的研究进展

抗原处理相关转运体(TAP)是一种异二聚体跨膜转运蛋白,具有高度多态性,主要功能是将胞质中加工产生的抗原肽转运到内质网腔,与主要组织相容复合体(MHC)Ⅰ类分子组装形成抗原肽-MHCI复合物后转运至细胞表面,被CD8^+T淋巴细胞识别,诱导机体产生细胞免疫应答。某些特定的人类疾病同TAP的多态性相关,包括多种肿瘤疾病、自身免疫疾病和传染性疾病等。本文就实验动物的TAP基因在与疾病相关性方面的比较医学研究进展做一综述。

抗原提呈相关转运体2基因多态性与乙型肝炎病毒感染的关系——附110例检测分析

目的:探讨抗原提呈相关转运体2(transporter associated with antigen processing2,TAP2)基因多态性与HBV感染的关联性。方法:用ELISA法、PCR-限制性片段长度多态性技术对44例慢性活动性乙型病毒性肝炎患者(A组)、36例乙型肝炎肝硬化组(B组)、30例慢性HBV无症状携带组(C组)和76名正常人(对照组)进行TAP2基因分型多态性分析。结果:A组及B组的TAP2-651C/C频率明显低于对照组(P<0.01),TAP2-651R/C频率明显高于对照组(P<0.05);C组的TAP2-687Q/Q频率明显低于对照组(P<0.05),TAP2-687S/S频率明显高于对照组(P<0.05)。ALT升高者TAP2-651C/C频率明显低于ALT正常者及对照组(P<0.01)。结论:TAP2基因多态性与HBV感染及预后密切相关。TAP2-651C/C可能是防止HBV感染的保护性基因,而TAP2-651R/C可能为HBV的易感基因。TAP2-687S/S基因型对肝脏功能有保护作用。携带TAP2-687QQ基因型者感染HBV后不易出现无症状携带状态。

喉鳞状细胞癌中HPV与TAP、CD8、HLA表达的相关性及临床意义

目的检测抑制基因蛋白16(P16)与抗原加工相关转运体(TAP)1、TAP2、人类白细胞抗原(HLA)、CD8在喉鳞状细胞癌中的表达,探讨喉鳞状细胞癌中TAP1、TAP2、HLA、CD8的表达及其与人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性及临床意义。方法选取滨州医学院附属医院2013年1月至2018年12月行手术切除的84例喉鳞状细胞癌患者的组织蜡块进行临床研究,其中男性68例,女性16例,年龄45~78岁,中位年龄63岁,采用免疫组化EnVision法检测84例喉鳞状细胞癌组织中P16和TAP1、TAP2、HLA、CD8的表达情况,分析其与临床病理特征的关系。进一步采用χ^(2)检验或Fisher精确检验、Spearman秩相关检验分析HPV感染与上述蛋白表达的相关性,采用Kaplan-Meier进行生存分析,Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。结果P16在喉鳞状细胞癌中的阳性表达率为11.9%(10/84),在癌旁正常组织中为阴性表达;CD8在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率为38.1%(32/84),低于癌旁正常组织[56.0%(47/84)],TAP1、TAP2、HLA在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率均低于癌旁正常组织[41.7%(35/84)比69.0%(58/84)、29.8%(25/84)比56.0%(47/84)、42.8%(36/84)比57.1%(48/84)],其中,TAP2在癌和癌旁正常组织中的表达差异有统计学意义(χ^(2)=5.80,P<0.05)。喉鳞状细胞癌组织中CD8的表达与临床分期有关,差异有统计学意义(χ^(2)=6.57,P<0.05);而TAP1、TAP2、HLA、P16的表达与临床病理因素无关。Spearman关联性分析结果提示TAP1表达与TAP2、CD8呈正相关(r=0.295、0.232,均P<0.05),HLA的表达与CD8的表达呈正相关(r=0.232,P<0.05)。结论TAP1、TAP2、HLA、CD8在喉鳞状细胞癌组织中低表达,提示肿瘤可能通过下调TAP1、TAP2导致HLA表达异常,从而抑制CD8免疫应答过程,进而抑制机体免疫反应,为肿瘤免疫逃逸机制提供理论支持。

抗原处理相关转运体的研究进展

抗原处理相关转运体（TAP）属于ABC转运体超家族的B亚家族，是由TAPl（7lKD8）和TAP2（75KDa）两个亚基形成的异源二聚体分子，位于内质网和顺式高尔基膜上，其功能是将胞浆内经过蛋白酶体降解后产生的肽段转运到内质网腔中，并在此与HLA—1分子结合，进一步被提呈到细胞表面引起特异性的细胞毒性T细胞（CTL）应答。本文就TAP的结构、疾病相关性及肿瘤免疫治疗等方面的研究进展做一综述。

人类抗原加工相关转运体结构和功能的研究进展

在人类获得性免疫中，为了有效的激活细胞毒T淋巴细胞，MHC-Ⅰ抗原肽复合体在细胞表面的表达甚为关健。这一过程涉及到多种蛋白的共同参与，如MHC-Ⅰ、抗原加工相关转运体（TAP）、蛋白酶体和各种分子伴侣如Tapasin，ERp57，钙网蛋白等等。而负责运输抗原肽，并把它负载到MHC-Ⅰ分子上的是TAP，这一步受阻，将导致细胞表面MHC-Ⅰ类分子的低表达或不表达，严重影响免疫监视。

抗原提呈相关转运体基因多态性与慢性HBV感染研究进展

抗原提呈相关转运体（TAP）在内源性抗原提呈过程中有重要作用，负责内源性抗原从胞浆到内质网腔的转运。TAP是由TAP1基因和TAP2基因编码的TAP1和TAP2组成的异二聚体。TAP基因具有多态性。乙型肝炎病毒（HBV）作为细胞内抗原，主要是经过内源性抗原加工和提呈途径而启动免疫应答的，TAP1／TAP2基因多态性的改变造成了分子结构异常，则会出现抗原呈递的功能障碍，抗原提呈不能有效进行，HBV抗原肽不能被细胞毒细胞识别而清除，则形成HBV的慢性持续感染。

抗原加工相关转运体1在前列腺癌组织中的表达差异

目的观察不同临床分期前列腺癌的抗原提呈路径的表达差异，探讨抗原加工相关转运体1（TAPl）与肿瘤发生及恶性程度相关性。方法收集前列腺癌、正常前列腺组织以及前列腺增生症（BPH）标本，进行Westernblot和免疫组织化学染色，并根据蛋白条带的灰度值和免疫组织化学结果进行定量评分。结果Westernblot显示前列腺癌标本中TAP1表达灰度为0．210±0．093，比较正常前列腺组（0．310±0．021）和BPH组（0．250±0．067），差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学显示前列腺癌中TAP1阳性染色评分为（1．200±0．316）分，比较正常前列腺组的（2．600±0．244）分和BPH组的（2．000±0．235）分，差异有统计学意义（P〈0．05），且TAP1表达与前列腺痛的分期和Gleason评分相关。结论检测TAPl的表达有助于判断前列腺癌的预后。

抗原处理相关转运体基因1基因codon 637 Asp/Gly多态性与慢性乙型肝炎相关性研究

目的探讨抗原处理相关转运体基因1（transporter associated with antigen processing1，TAP1）codon637多态性与慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）的关系。方法142例CHB患者（CHB组）和150例体检健康者（对照组），2组采用PCR-限制性片段长度多态性法对TAP1-codon637Asp／Gly单核苷酸多态性进行基因分型，以谷丙转氨酶（glutamic-pyruvictransaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetictransaminase，GOT）、总胆红素、γ-谷氨酰转肽酶、白蛋白、乙型肝炎E抗原、乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）-DNA及其病毒载量、外膜大蛋白、前s1抗原为检测指标。结果CHB组GPT[（72．7l±16．64）u／L]、GOT[（65．82±9．56）u／L]水平明显高于对照组[GPT为（31．07±10．25）u／L，GOT为（29．06±7．43）u／L3（P〈0．05）；CHB组TAPl-637位点Asp／Asp基因型分布频率（45．07％）低于对照组（68．67％），Asp／Gly、Gly／Gly基因型分布频率（47．18％、7．75％）高于对照组（28．00％、3．33％）（P〈0．05）；与Asp／Asp基因型患者相比，Asp／Gly和Gly／Gly基因型患者发生CHB的风险分别增加2．567倍（95％CI：1．563-4．216，P=0．000）和3．541倍（95％CI：1．176-10．660，P=0．018）；CHB组Gly等位基因频率为31．34％，对照组为17．33％，Gly等位基因可增加CHB患病风险（OR=2．671，95％CI：1．656-4．307，P=0．000）；TAP1—637位点Gly等位基因与HBV—DNA阳性率相关（OR=1．854，95％CI：1．049-3．277，P=0．032）；HBV—DNA病毒载量在104-107copies／mL时，Asp等位基因分布频率和Gly等位基因比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论TAP1—637位点Asp／Gly单核苷酸多态性与CHB患病风险相关，且等位基因Gly可能是HBV感染的易感基因。

TAP基因多态性与维吾尔族人群类风湿关节炎的相关性

目的研究抗原处理相关转运体(TAP)在新疆维吾尔族人群基因多态性及其与类风湿关节炎(RA)的相关性。方法采用ASPCR方法对64例RA患者和72例正常人的TAP基因进行分析。结果健康维吾尔族人群TAP1 333位和637位等位基因基因型分别以I和D为主,表现型主要为II和DD,TAP2 379、565、665、687等位基因基因型分别以I-A-T-S为主,表现型以II-AA-AT-SS为主;RA患者TAP2 379-V,687-Q,687-QQ频率显著降低,687-S,379-II,687-SS频率显著升高。结论维吾尔族健康人群及RA患者TAP基因多态性有不同于其他民族人群的基本特点。TAP2 379-II、687-SS型患RA的相对危险性增加,并可能是维吾尔患者RA的易感基因。

LMP7、TAP2基因多态性与云南汉族非小细胞肺癌的相关性

目的:探讨低相对分子量蛋白酶体7基因(LMP 7)及抗原处理相关转运体2基因(TAP 2)中的单核苷酸多态性(SNP)与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性。方法:选取云南汉族非小细胞肺癌患者467例作为病例组、同期健康正常人群488例作为对照组,采用Taq Man探针基因分型方法对TAP2基因的SNP位点rs241447及LMP7基因的SNP位点rs2071543进行基因分型,分析rs241447和rs2071543等位基因和基因型在病例组和对照组间的分布差异,分析这两个SNP位点在肺癌不同临床分期的中分布差异。结果:rs241447在对照组和病例组中基因型的分布频率比较,差异有统计学意义(P=0.015);在超显性遗传模式下,rs241447基因型C/C-T/T可能是云南汉族人群非小细胞肺癌的风险因素(OR=1.38,95%CI为1.07~1.78,P=0.014),rs2071543的等位基因和基因型在对照组和病例组中的分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TAP2基因中的SNP位点rs241447可能与云南汉族人群非小细胞肺癌的易感性相关。

vIL-10对鼻咽癌细胞株MHC-1类分子抗原加工提呈“操纵子”表达的影响

目的研究病毒白介素-10(vIL-10)对鼻咽癌细胞株MHC-1类分子抗原加工提呈"操纵子"表达的影响。方法收集不同时间段vIL-10处理的鼻咽癌细胞(CNE-1和CNE-2),采用RT-PCR、Western blot方法检测vIL-10处理的鼻咽癌细胞中MHC-1类分子抗原加工提呈"操纵子"(TAP-1、2,LMP-2、7及HLA-I)表达的变化。结果1mRNA水平:CNE-1和CNE-2的TAP-1水平在不同时间点均未表现出显著差异;vIL-10作用1、4、6、12h时,CNE-1和CNE-2的TAP-2、LMP-2均未出现变化,24h时,两者均出现显著下降甚至消失;CNE-1在vIL-10作用后4h即出现LMP-7下降,而CNE-2在vIL-10作用后6h出现下降;在vIL-10作用24h时CNE-1和CNE-2的HLA-I出现显著下降。2蛋白水平:vIL-10作用后24h时,两种细胞的TAP-1均出现显著下降,TAP-2则在vIL-10作用后1、6、12、24h出现逐渐下降;CNE-2的LMP-2、LMP-7在vIL-10作用后随时间逐渐下降,而CNE-1的两种蛋白仅在作用后12h出现显著下降;HLA-I在vIL-10作用后出现下降趋势,但在CNE-1中各时间段变化无统计学差异,CNE-2在24h显著下降。结论 vIL-10可明显抑制鼻咽癌MHC-I类分子抗原加工和提呈的"操纵子"的表达,并且呈一定的时间依赖性。

中国海南黎族人群TAP1基因多态性与结核病的关联性研究

目的:研究海南黎族人群抗原处理相关转运体基因1(TAP1)多态性与肺结核病(PTB)易感性的关系。方法:应用PCR-RFLP技术对205例海南黎族肺结患者及217例海南黎族健康人群TAP1-1/TAP1-2(即Codon333/637)多态性进行检测。并对其易感性进行分析。结果:(1)海南黎族人群TAP1-1/TAP1-2基因多态性位点具有多态性(A→G);(2)TAP1-1Codon333多态性位点纯合型Val/VaL的基因频率病例组为4.88%,低于对照组5.33%,而病例组的杂合型Ile/Val频率为44.39%,明显高于对照组26.73%,在两组人群中,野生型Ile/Ile与杂合型比较,P=0.008,OR=1.92(95%CI:1.19～3.12),差异有意义,而与纯合型比较,无差异(P>0.05);(3)TAP1-2Codon637多态性位点纯合型Gly/Gly、杂合型Asp/Gly的基因频率在两组人群中的差异有高度显著性(P<0.01),其中野生型与杂合型比较OR=2.87(95%CI=1.75～4.71),与纯合型比较,OR=3.94,(95%CI=1.82～8.53)。结论:TAP1基因Codon637位点多态性可能是海南黎族人群肺结核的易感因素。

TAP-1、TAP-2及HLA-I在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的探讨鼻咽癌组织中MHC-I类分子抗原加工提呈"操纵子"(即TAP-1、TAP-2及HLA-I)表达的变化及其与临床因素的关系。方法免疫组织化学法(IHC)检测鼻咽癌石蜡切片中TAP-1、TAP-2及HLA-I的表达,采用流式细胞仪(FCM)检测鼻咽癌患者及对照组外周血中CD4+T、CD8+T细胞比例,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测空腹外周静脉血IL-10含量,并对以上结果进行统计分析。结果 TAP-1、TAP-2及HLA-I在鼻咽癌组织中表达分别为43.1%、46.55%、50%,均低于鼻咽正常组织中的表达90%、95%、95%(P<0.05);鼻咽癌组CD4+T细胞比例明显低于对照组[(33.41±10.04)%vs.(40.15±3.56)%](P<0.05),CD8+T细胞比例与对照组比较差异无统计学意义[(25.32±8.29)%vs.(22.89±2.24)%,P>0.05],鼻咽癌IL-10表达明显高于对照组[(13.12±1.23)ng/mL vs.(3.69±1.03)ng/mL,P<0.05];TAP-1、TAP-2及HLA-I表达与年龄、性别无相关性(P>0.05),与TNM分期、有无淋巴结转移及有无远处转移密切相关(P<0.05);CD8+T细胞比例与TAP-1、TAP-2及HLA-I表达成正比,IL-10表达与TAP-1、TAP-2及HLA-I表达成反比,而CD4+T细胞比例与TAP-1、TAP-2及HLA-I表达无明显相关性;Kaplan-Meier分析提示,临床分期、有无淋巴结转移、有无远处器官转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、HLA-I表达与鼻咽癌患者预后相关,差异具有统计学意义(P<0.05);Logistic回归模型分析显示,有无远处器官转移及HLA-I表达为鼻咽癌患者独立预后因素(P=0.043,P=0.045)。结论鼻咽癌中TAP-1、TAP-2及HLA-I低表达,且与患者免疫功能低下相关;远处器官转移及HLA-I低表达预示鼻咽癌患者预后不良。

中药清毒栓对HeLa细胞MHC-Ⅰ抗原呈递通路相关分子表达的影响

目的:探讨中药清毒栓治疗宫颈高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的分子机制。方法:以HPV18阳性的宫颈癌细胞系He La为细胞模型,清毒栓水提醇沉液、β-榄香烯、干扰素α-2b进行干预;分别采用Western blot及Real-time PCR检测主要组织相容性复合物-Ⅰ(MHC-Ⅰ)抗原呈递通路相关分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白及基因表达差异。结果:与对照组相比,清毒栓及β-榄香烯均可显著上调He La细胞内抗原呈递通路相关分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白表达(P<0.05),清毒栓可上调4种分子的基因表达(P<0.05),β-榄香烯仅能可上调TAP2的基因表达(P<0.05),干扰素α-2b对该4种分子的基因表达无影响。结论:中药清毒栓可通过调节抗原呈递通路相关分子的蛋白及基因表达,起到促进抗原呈递的作用,这可能是该方疗效的作用机制之一。

导入TAP基因上调其在肺腺癌细胞系的表达

目的 克隆TAP1及TAP2基因 ,分别转染TAP1及TAP2表达下调的人肺腺癌细胞系Anip973,以提高其表达水平 ,从而增强肿瘤细胞的抗原提呈能力。方法 采用RT PCR方法自EBV刺激的B LCLs克隆TAP1及TAP2基因 ,与pcDNA3.1 V5 His TOPOTAExpressionvector连接 ,构建真核细胞表达载体 ,脂质体法 (LipofectamineTM2 0 0 0 )转染人肺腺癌细胞系Anip973,经G4 1 8筛选 4～ 6周 ,通过RT PCR检测TAP1及TAP2的表达。结果 经测序确认已成功克隆人TAP1及TAP2基因 ,建立稳定表达TAP1或TAP2的细胞系 ,经RT PCR分析 ,Anip973细胞TAP1、TAP2的mRNA表达明显增加。结论 基因转染可恢复肿瘤细胞TAP1及TAP2的表达 。