竞争ELISA测定单抗衍生物的抗原结合活性

应用简易的测定单抗衍生物抗原结合活性的竞争ＥＬＩＳＡ方法。不同浓度的抗铁蛋白单克隆抗体Ａ－ｈＦ－ｃ及其衍生物与一定浓度的Ａ－ｈＦ－Ｃ－ＨＲＰ偶联物一起竞争固相铁蛋白抗原，以５０％偶联物被竞争抑制时的抗体浓度作为活性相互比较的依据，所得到的结果能够较真实地反映单抗衍生物活性保留的百分比。

纳米抗体结构特点及其抗原结合活性研究

纳米抗体(nanobody,Nb)是由骆驼科等动物体内天然缺失轻链的重链抗体可变区所形成的单域抗体,具有高亲和力、高稳定性、高表达量以及低免疫原性、较低生产成本等特点,在医学治疗、诊断及食品安全检测等领域备受关注.近年来关于纳米抗体的结构特点及其抗原结合活性方面的研究成果较多,为从微观层面认识纳米抗体优良特性的结构基础提供了理论依据.本文主要综述了纳米抗体的结构特点、结构与其抗原结合活性关系等,以期对进一步认识纳米抗体良好抗原结合活性和基于结构信息的定向改造以提高其应用性能等研究提供一定的参考价值.

重组人源化兔抗血管内皮生长因子单克隆抗体的抗原结合活性测定

目的采用直接ELISA法测定重组人源化兔抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体的抗原结合活性。方法以VEGF-Fc为包被抗原,采用直接ELISA法测定不同浓度重组人源化兔抗vEGF单抗参考品和供试品与抗原的结合活性,根据供试品及参考品的EC50值计算供试品的相对结合力,并分析该法的精密性。结果重组人源化兔抗VEGF单抗供试品及参考品的抗原结合均存在量效关系,且符合四参数方程。同一批次的供试品单抗原液的相对结合活性分别为参考品的(90.43±18.74)%、(123.56±18.40)%和(106.83±18.47)%,均值为(106.94±16.57)%。3次试验的变异系数分别为20.72%、14.89%和17.29%。同一批次的供试品成品的相对结合活性分别为(97.34±18.42)%、(123.30±11.08)%和(93.91±4.57)%,变异系数分别为18.93%、8.96%和4.87%。结论 直接ELISA法精密性良好,操作简便,可用于重组人源化兔抗VEGF单抗抗原结合活性的常规检测。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9单克隆抗体抗原结合活性间接ELISA测定方法的建立

目的建立前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)单克隆抗体抗原结合活性的间接ELISA测定方法。方法利用链酶亲和素-生物素系统捕获包被PCSK9蛋白,采用间接ELISA法检测PCSK9单抗参比品和供试品,通过拟合四参数方程Y=(A-D)/[1+(X/C)~B]+D,得出两者的半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC_(50)),计算供试品的抗原结合活性。同时验证该方法的专属性和精密性。结果 PCSK9单抗参比品、供试品及Evolocumab(Amgen)的曲线均呈显著的剂量依赖关系,符合四参数方程,且R^2>0.99;抗CD115抗体及空白稀释液不存在类似的剂量效应曲线;重复性、人员及日间精密性的相对标准偏差(relative standard deviatin,RSD)分别为7.5%、11.3%和10.4%,均<15%。结论成功建立了抗PCSK9单抗抗原结合活性的间接ELISA检测方法,该方法专属性和精密度良好,可用于PCSK9单抗抗原结合活性的常规测定。

重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性的检测方法,并进行验证。方法测定3种人淋巴瘤细胞(MC/CAR、HUT78、RAMOS)CD52抗原的表达率,选择CD52表达率最高的作为靶细胞。以系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体的参比品和供试品作用表达CD52抗原的人淋巴瘤细胞,FITC标记的兔抗人Ig G结合人淋巴瘤细胞上的重组人源化抗CD52单克隆抗体,流式细胞分析仪测定几何荧光均数。通过四参数方程拟合,计算参比品和供试品的半数有效浓度(EC50)及相对结合活性。并对该方法的专属性、准确性、精密性、线性范围和耐用性进行验证。结果淋巴瘤MC/CAR细胞CD52抗原表达率最高,确定该细胞为靶细胞。CD52抗原与无关抗体不存在特异性结合;重复3次测定不同理论相对结合活性人源化抗CD52单克隆抗体参比品的回收率在97.4%~111.9%之间,相对结合活性及回收率的RSD值均在10%以内;同一实验人员于同一天6次重复检测重组人源化抗CD52单克隆抗体相对结合活性在86.93%~114.42%之间,RSD值在10%以内,3 d内不同实验员分别检测5个效价样品的相对结合活性的RSD在20%以内;在重组人源化抗CD52单克隆抗体理论效价50%~150%范围内,与相对结合活性呈良好的线性,线性回归方程为y=1.045 2 x-1.082,R2为0.992 1;MC/CAR细胞在第28代时仍适用于抗CD52抗体相对结合活性的测定。结论该方法具有良好的特异性、准确性、精密性、线性和耐用性,且操作简便,可用于重组抗CD52抗体抗原结合活性的常规检测。

人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5～5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。

抗癌胚抗原免疫毒素生物学功能的研究

为了研究免疫毒素发挥生物学作用的全过程 ,构建了两种不同形式的基于假单胞菌外毒素 (PseudomonasexotoxinA ,PE)的抗癌胚抗原 (carcinoembryonicantigen ,CEA)免疫毒素CEA (Fv) /PE38/KDEL和PE35 /CEA(Fv) /KDEL .用流式细胞术经间接免疫荧光法测定免疫毒素的抗原结合活性 .免疫毒素的内化 (internalization)通过间接免疫荧光标记的方法在激光共聚焦显微镜下进行检测 ,采用流式细胞术进行免疫毒素内化的定量分析 .细胞凋亡采用FITC annexinV/PI双荧光染色方法进行分析 .用噻唑蓝 (MTT)法测定免疫毒素的靶细胞杀伤功能 .对两种形式的免疫毒素在各个功能阶段的性质进行研究和比较 ,全面展现了免疫毒素发挥生物学功能的过程及各个生物作用过程之间的相互影响 ,为详尽的机制研究和免疫毒素的进一步优化改造提供了重要的依据 .

HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析

【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。

天花粉蛋白基因的克隆、表达和活性鉴定

用 PCR( Polymerase Chain Reaction)扩增出天花粉蛋白 ( Trichosanthin,TCS)基因全长序列 ,插入表达载体 .经双酶切鉴定及测序分析 ,表明阅读框正确 .表达 His- TCS活性融合蛋白并纯化天花粉蛋白 ,鉴定出其具有 RNA

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25%，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。 结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。

抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定

前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.

抗HBsAg碱性磷酸酶双功能抗体的构建及对临床标本的初步检测

酶联免疫吸附试验(ELISA)在对微量抗原或抗体的检测中具有重要意义,酶标记物主要是抗体,其标记酶一般为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),常规的酶标抗体都是采用化学交联方法制备的,需要交联、纯化等多步蛋白质操作,易失活、成本高。随着分子生物学技术的发展,采用基因工程方法可将抗体基因和酶基因融合表达,获得既有抗体的抗原结合活性又有酶的催化活性的双功能抗体融合蛋白,不仅易于大量制备、成本低。

基因工程小分子抗体在抗病毒疾病中的研究进展

1.概述近年来,基因工程技术和蛋白工程技术得到了飞速发展。人类应用这些高新技术制备出了新一代抗体——基因工程抗体。由初始的鼠一人嵌合抗体到随后的单域抗体,单链抗体,重构人源化抗体等。这新一代抗体的产生都是在尽最大可能地制备出可安全、有效地用于人体内进行诊断、治疗的新型抗体制剂。基因工程抗体制备快速,成本低廉,为抗体成为新型的常规临床制剂打下了良好的基础。

含有E tag的抗结肠癌相关抗原单链抗体的研制

在已构建的抗结肠癌相关抗原单链抗体基因的基础上,为方便其活性测定,设计了含有E tag的引物进行PCR扩增,以scFv-E tag融合基因的形式构建在质粒pET-22b(+)中,并在大肠杆菌中进行了表达。对表达产物的主要成分包涵体进行了变性、复性,ELISA及免疫组化SABC法对该单链抗体进行活性测定,结果表明它具有与原代单克隆抗体相似的抗原结合活性及组织特异性。

抗Her-2单克隆抗体A及上市原研药生物学活性研究及评价

目的:评价抗Her-2单克隆抗体A的生物学活性并与上市原研药进行比较。方法:利用表面等离子共振技术比较抗Her-2单克隆抗体A及上市原研药的抗原-抗体结合活性;利用BT-474细胞模型测定抗Her-2单克隆抗体A对肿瘤细胞的生长抑制活性并与上市原研药进行比较;以SK-BR-3细胞作为靶细胞,NK92MI-CD16a作为效应细胞,检测抗Her-2单克隆抗体A的抗体依赖的细胞介导的细胞杀伤作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),并与上市原研药进行比较。结果:抗Her-2单克隆抗体A抗原抗体结合活性、对BT-474细胞的生长抑制活性以及ADCC活性批间一致,并与上市原研药高度相似。结论:抗Her-2单克隆抗体A的抗原抗体生物学活性批间一致,并与上市原研药具有高度的相似性和可比性。

抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1抗体可变区基因克隆、串联和表达

目的克隆抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1,HnRNPA2/B1)单克隆抗体的重链可变区(variableregionofheavychain,VH)和轻链可变区(variableregionoflightchain,VL)基因,构建抗HnRNPA2/B1单链抗体(singlechainFv,ScFv)基因,并在大肠杆菌表达。方法采用斑点ELISA、Western印迹和免疫组化检测抗HnRNPA2/B1单克隆抗体3E8的特异性,并通过逆转录-聚合酶链反应、重叠延伸PCR来克隆、串联VH和VL基因,构建抗HnRNPA2/B1ScFv基因pET28(a+)表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、竞争抑制ELISA检测表达产物。结果3E8抗体能特异性地与HnRNPA2/B1合成肽以及3株人肺癌细胞内HnRNPA2/B1结合;克隆的VH基因为345bp,VL基因为309bp,符合小鼠抗体可变区特性;抗HnRNPA2/B1ScFv蛋白以包涵体形式表达,分子量约28000,并具有与抗原结合活性。结论成功构建了抗HnRNPA2/B1ScFv基因克隆,并在大肠杆菌中获得了功能性表达,为阐明HnRNPA2/B1与肺癌相关性奠定了实验基础。

二步法预定位技术对荷人肝癌裸鼠模型的MR免疫成像研究

目的利用生物素亲和素系统(biotin avidinsystem,BAS)的靶向定位效应和生物放大作用,提高MR分子免疫成像的敏感性。方法制备生物素化抗人肝癌细胞单克隆抗体HAb18并测定其生物素化程度及抗原结合活性。20只荷人肝细胞癌裸鼠分为3组,二步法预定位组8只,先静脉注射生物素化单克隆抗体600μg,24h后再给予钆喷替酸葡甲胺链霉亲和素(Gd DTPA streptavidin,Gd DTPA SA);HAb18单克隆抗体Gd DTPA组6只,经尾静脉注射Gd DTPA HAb18;Gd DTPA对照组6只,静脉注射Gd DTPA。对实验动物行MR扫描,测量SET1WI平扫及增强后10、30、60min及3、6、12、24、48h图像内肿瘤的信号强度,绘制信号强度时间曲线,并计算肿瘤强化率及对比度噪声比(contrast to noiseratio,CNR)。结果HAb18单克隆抗体经生物素化后,每个抗体分子平均可结合20个分子生物素,其抗原结合活性约为91%。二步法预定位组内,肿瘤信号强度缓慢升高,增强后第6小时,肿瘤的强化率、CNR达到最大值,与其他两组相比较差异有统计学意义。48h后,肿瘤的强化仍肉眼可辨。单克隆抗体组内,肿瘤表现为缓慢轻度强化,增强后24h的强化率达13.5%,肿瘤信号强度、CNR与平扫比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。Gd DTPA对照组内,肿瘤表现为快进快出特点的强化特点。结论二步法预定位技?

人源抗肝癌单链抗体的构建及鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体。方法从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源抗肝癌噬菌体抗体库并筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与抗原结合活性。结果成功构建了库容为4.0×106的人源抗肝癌单链抗体库,初步筛选到与肝癌细胞特异性结合的单链抗体。结论成功构建人源抗肝癌单链抗体,为进一步临床应用奠定基础。

对一株基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学鉴定

目的对1株基因工程人抗角蛋白抗体识别抗原的特性进行鉴定。方法利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白的Fab片段的质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达出Fab片段,用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性,用蛋白免疫印迹和竞争抑制性ELISA检测抗体所识别的角蛋白组分。结果该株基因工程人抗角蛋白抗体的结合活性和特异性良好,所识别的抗原为相对分子质量46000角蛋白,为特异性人抗角蛋白K17抗体。结论该抗体具有优良的免疫学特性,有必要对其生物学活性和临床应用前景做进一步探讨。