大肠杆菌表达抗原结合片段的策略

背景:抗原结合片段在大肠杆菌中表达量低是制约其大规模生产和应用的主要因素,通过对宿主细胞、表达载体、表达条件和纯化条件等进行改造与优化,将有可能获得基因工程抗体的高效表达。目的:总结并介绍抗原结合片断抗体在大肠杆菌中的表达和纯化的最新策略。方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:1990/2010)和Medline数据库(1990/2010),检索词分别为"大肠杆菌,抗原结合片段,表达,纯化,抗体"和"Escherichiacoli,Fab,Expression,antibody,purification",语言分别设定为中文和英文。从Fab抗体在大肠杆菌中表达方式及纯化2方面进行总结,对抗原结合片断抗体在大肠杆菌中最新的表达和纯化等方面进行介绍。结果与结论:共检索到125篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入30篇文章。结果表明抗原结合片段抗体在大肠杆菌中表达方式主要为细胞质表达和分泌表达,其纯化主要有金属离子螯和纯化和特异蛋白亲和纯化,抗原结合片断在大肠杆菌中表达的影响因素是多方面且相互关联的。目前研究对大幅提高抗原结合片断抗体在大肠杆菌中最新的表达量和最适纯化策略尚不一致。

阿达木单抗抗原结合片段在大肠杆菌中的共分泌表达和纯化

构建阿达木单抗抗原结合片段(Fragment antigen binding,Fab)表达载体,使其在大肠杆菌内高效共分泌表达,周质空间中获得具有活性的目的蛋白。将带有信号肽的Fab片段重链与轻链克隆于带有双启动子的pETDuet-1载体内,BL21(DE3)Star宿主菌内利用IPTG低温诱导双基因共分泌表达,选用"渗透压冲击法"提取周质蛋白,色谱柱纯化,Western blot分析纯化结果,与纯化的人肿瘤坏死因子(TNF-α)相互作用进行活性分析。SDS-PAGE与Western blot分析在细胞周质中同时存在重链和轻链,大小与预期相符,ELISA试验显示Fab片段与TNF-α结合。结论:得到有活性的人源的阿达木单抗的Fab的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础。

双亲和柱分离纯化高纯度抗体Fab酶切片段

目的建立利用抗原亲和柱及蛋白G亲和柱纯化抗体木瓜蛋白酶酶切产物中高纯度Fab片段的方法。方法以抗体对应的抗原蛋白与NHS-activated Sepharose 4Fast Flow活化偶联填料偶联制备抗原免疫亲和层析柱,将抗体木瓜蛋白酶酶切产物分别通过蛋白G柱及抗原亲和柱制备抗体的Fab片段。通过SDS-PAGE电泳、ELISA测定及临床类风湿因子阳性血清的干扰实验鉴定其制备效果。结果抗体木瓜蛋白酶酶切产物分别通过蛋白G柱及抗原亲和柱后可以依次去除抗体Fc片段及未切开的抗体、木瓜蛋白酶及失活的Fab抗体片段,最终获得高纯度、高活性的Fab抗体片段。SDS-PAGE电泳、ELISA测定抗体Fc段被完全去除,双抗夹心ELISA检测能消除类风湿因子阳性血清导致的假阳性。结论成功建立了双亲和柱分离纯化抗体Fab片段的方法,该方法适用于快速、高质量、大规模制备Fab抗体片段。

人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性

目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性、高亲和力的全人抗体Fab片段。方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性。结果:Western blot、免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA、荧光激活细胞分类术、免疫荧光分析、免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性。结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子。

高纯度抗五步蛇毒F(ab′)_2血清的制备

目的摸索高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法,以降低抗血清治疗毒蛇咬伤时因纯度不高发生的过敏和其他不良反应。方法从免疫后的马血浆中先提取IgG,然后酶解,通过疏水层析得到F(ab′)2片段,以SDS-PAGE电泳确定纯度,以小鼠体外中和试验确定F(ab′)2活性片段的中和能力。结果制备的抗五步蛇毒血清F(ab′)2冻干品纯度质量分数为91.3%,中和五步蛇毒干粉质量比为15∶1。结论采用新方法制备的F(ab′)2活性片段纯度质量分数能从70%提高到90%以上。

抗TNF-α蛋白Fab抗体的制备和鉴定

目的制备人源性抗肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白的可溶性Fab抗体。方法用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体;ELISA筛选出的2株抗体(TA-04、TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应。结论成功制备并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体。

凝胶过滤层析一步纯化MC-LR Fab的方法及吸附机制初探

为高效制备高纯微囊藻毒素(MC-LR)Fab片段,采用木瓜蛋白酶酶解腹水中纯化获得的单克隆抗体,利用该Fab片段与凝胶过滤层析介质结合的特殊现象分离酶解混合物。通过单因素实验考察流动相中离子强度和pH对Fab片段在柱中保留行为的影响,结合Fab片段等电点(pI)及聚集性质分析二者结合机制。结果表明,腹水经protein G纯化得到纯度大于90%的IgG,IgG经木瓜蛋白酶酶解,主要产物为Fab片段、Fc片段和少量IgG,酶解混合物经凝胶过滤层析一步纯化获得纯度为94.5%,回收率为51%,对MC-LR抑制率为94%的Fab片段。Fab片段pI为6.02,由于表面较强疏水性产生聚集,疏水吸附导致Fab片段与凝胶过滤层析介质结合,降低流动相中离子强度,减弱疏水作用同时提高pH增强离子排阻作用可使Fab片段消除吸附,实现了Fab片段的高效制备。

EBAG9/RCAS1与肿瘤的关系及其免疫逃避机制的研究进展

雌激素受体结合片段相关抗原9(EBAG9)和SiSo细胞上表达的受体结合型肿瘤相关抗原(RCAS1)是同一种蛋白质,可表达在多种恶性肿瘤细胞中,与肿瘤的恶性程度、侵袭性特征以及不良预后相关。肿瘤的免疫逃避是肿瘤发生、发展的重要机制之一,而EBAG9/RCAS1可诱导免疫细胞(如T细胞)凋亡或抑制免疫细胞的细胞毒性,使肿瘤逃避免疫系统的监控和清除,导致肿瘤不断生长、发展。因此,明确EBAG9/RCAS1参与免疫逃避的具体机制,可为癌症的靶向治疗提供新思路。