个体化肿瘤新生抗原肽疫苗中残留有机溶剂的顶空GC法测定

目的建立个体化肿瘤新生抗原肽疫苗组中8种有机溶剂残留量的测定方法。方法采用顶空气相色谱(顶空GC)法,FID检测器,检测器温度250℃;色谱柱为Agilent DB-1毛细管色谱柱(30 m×0.53 mm,3μm),程序升温:起始柱温70℃(保持11 min),以50℃/min升温至130℃(保持9 min),再以50℃/min升温至200℃(保持2 m in);载气为氮气,柱流速1.0 mL·min^(-1);进样口温度200℃。有机溶剂检测项目为甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、乙醚、三乙胺、哌啶和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。结果8种溶剂的专属性、定量限与检测限、线性与范围、准确度、精密度均达到了ICH指导原则中对残留溶剂测定的验证要求。结论建立的方法能有效控制个体化肿瘤新生抗原肽疫苗组中甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、乙醚、三乙胺、哌啶和DMF的残留量。

血吸虫多抗原肽疫苗的合成及生物活性

目的：合成由寡聚赖氨酸和曼氏血吸虫２８ＫｕＧＳＴ抗原肽段２６４３（Ｐ２６）、１４１１５３（Ｐ１４１），日本血吸虫２６ＫｕＧＳＴ抗原肽段１８７２０２（Ｊ１８７）组成的血吸虫多抗原肽疫苗，通过活性试验考察其抗原性及对实验动物的保护性免疫效果。方法：用固相逐步接肽法合成多抗原肽疫苗，产物经斑点酶联免疫吸附试验测定抗原性，并在无免疫佐剂存在下接种小鼠，以日本血吸虫尾蚴攻击感染，６周后剖杀小鼠进行体内成虫和肝内虫卵计数。结果：合成多抗原肽均能与感染日本血吸虫的病人或病兔血清结合，接种（Ｐ１４１）４ＭＡＰ、（Ｊ１８７）４ＭＡＰ的昆明小鼠和接种（Ｐ２６）８ＭＡＰ的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，与对照组相比成虫检获数分别减少６４６％，４１３％和２８１％；每克肝脏虫卵数分别减少５４９％，４５６％和４０６％。结论：合成血吸虫多抗原肽疫苗能诱导小鼠产生抵抗日本血吸虫感染的保护性免疫力。

间接偶联法合成Aβ_(1-15)多重抗原肽疫苗及其免疫学活性

目的探索合成Aβ1-15重抗原肽疫苗的方法,并对其免疫学活性进行鉴定。方法采用间接偶联法合成8分支Aβ1-15重抗原肽（MAP）,通过高效反相液相色谱（RP-HPLC）、SDS-PAGE以及氨基酸成分分析对其进行初步鉴定。以合成的MAP Aβ1-15C57BL/6小鼠,用ELESA法检测血清特异性抗Aβ抗体。结果间接偶联法合成的MAP Aβ1-15RP-HPLC层析后,呈现为一宽大主峰。SDS-PAGE检测显示,共有8条蛋白带,条带梯度比较均匀,分别为1～8分支的MAP Aβ1-15基酸组份及含量基本与Aβ1-15肽的序列一致。以合成的MAP Aβ1-15免疫C57BL/6小鼠后,可产生高滴度的特异性抗Aβ抗体。结论间接偶联法可成功地合成MAP Aβ1-15,且具有很好的免疫学活性,但合成的MAP产物难以纯化。

基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用

目的构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统，制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly—Asp．Lys的多抗原肽（MAP）疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性。方法采用连接引物PCR构建含肠激酶（EK）位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统。表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用SephadexG-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段。采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly．Asp—Lys载体分子交联，制备出多抗原肽疫苗MAP—rUreB322／B527。采用ELISA和Westernblot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322／527的抗原性和免疫反应性。采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB／c小鼠模型检测MAP—rUreB322／527免疫保护效果。结果获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统，目的融合蛋白8x[rEK—UreB322-EK—rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％。肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段。rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly—Asp-Lys交联率高达92．5％。幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB．IgG均能识别rUreB322．EK、rUreB527．EK和MAP．rUreB322／527并与之结合。MAP．rUreB322／527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB（P〈0．05）。50或100p,gMAP—rUreB322／527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率（83．3％和91．7％）明显高于等量rUreB（41．7％和50．0％）（P〈0．05）。结论本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统，基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAP—rUreB322／527能显著提高免疫保护效果。

不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势T-B联合抗原表位及其免疫原性研究

目的了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序。采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PIII蛋白(rPIII)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性。结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3%~100%和99.3%~100%。OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位。Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9%(59/62)、69.4%(43/62)和74.2%(46/62)NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性。结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位。

用混合氨基酸接肽的方法合成OX型肽亚库

肽库合成是药物研究组合化学策略的重要技术之一。建立合成OX型肽亚库的固相合成方法 ,接肽反应采用等摩尔的Fmoc氨基酸混合物和DIC HOBt缩合方法 ,以高浓度的缩合剂和不断缩减溶剂的策略促进偶联反应进行完全。产物的氨基酸组成分析结果显示 ,所使用的常见氨基酸都能以相近的摩尔比例接肽至X位置。推测经多次接肽后最终形成的肽亚库中 ,含低活力氨基酸较多的肽其浓度虽然会较低一些 ,但影响不会太大 ,且本合成方法成本相对较低 ,故可为抗原表位分析、多肽药物筛选及构效关系分析提供一种有用的工具.

转移性肾细胞癌免疫治疗进展

肾癌是常见的恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤的2%-3%[1]。约1/3的肾癌患者在初诊时就已经发生转移,40%的局限性肾癌最终也会出现远处转移[2]。转移性肾细胞癌（metastatic renal cell carcinoma,mRCC）的预后很差,5年生存率不到10%[3]。肾癌对放疗和化疗不敏感,所以外科手术一直是肾癌积极有效的治疗手段.

不可分型流感嗜血杆菌Hap黏附素T-B优势抗原表位及其免疫原性研究

目的 了解无荚膜型流感嗜血杆菌（NTHi）临床菌株中Hap黏附素编码基因（hap）分布及其序列保守性,筛选并鉴定Hap蛋白优势T和B细胞（T-B）联合抗原表位及其免疫原性.方法采用生物信息学软件分析NTHi菌株hap基因序列保守性并预测其T-B联合抗原表位.采用PCR扩增NTHi临床菌株hap基因5′端156 bp和3′端855 bp片段（hap-5′-156和hap-3′-855）后测序.构建Hap蛋白N端52 aa和C端285 aa片段（Hap-N52和Hap-C285）7个T-B联合抗原表位肽噬菌体展示系统.采用Western blot和ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白（rPⅢ）展示的T-B联合抗原表位肽抗原性和免疫反应性.结果 hap基因产物为NTHi膜表面蛋白.不同NTHi菌株hap基因5′端156 pb和3′端855 bp序列相对保守,中间区变异较大.56株NTHi临床菌株均能检出hap-5′-156和hap-3′-855片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性为92.3％～100％.Hap-N52片段中Hap-N5-24以及Hap-C285片段中Hap-C4-27、Hap-C28-47、Hap-C114-129、Hap-C150-173、Hap-C200-227和Hap-C241-267为评分较高且变异较小的预测T-B联合抗原表位.Western blot和ELISA检测结果显示,rPⅢ展示的Hap-C4-27或Hap-C150-173表位肽能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带且96.9％（63/65）和92.3％（60/65）NTHi感染患儿血清标本相应抗体阳性.结论 hap基因在NTHi临床菌株中分布广泛且5′端156 pb和3′端855 bp序列保守.Hap-C4-27和Hap-C150-173为Hap蛋白优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位.