抗原血清学识别重组表达克隆技术的优化

背景:抗原血清学识别重组表达克隆技术的应用有许多报道,但存在假阳性较高、稳定性欠佳等诸多问题。目的:优化抗原血清学识别重组表达克隆技术,建立灵敏且稳定的技术体系。方法:利用抗原血清学识别重组表达克隆技术,比较血清的处理方法、异丙基-β-D硫代半乳糖苷的加入方式、不同的封闭条件及培养基厚度对显色结果的影响,观察噬菌斑显色深浅、背景处理及假阳性的产生。结果与结论:直接法预处理血清、异丙基-β-D硫代半乳糖苷浸泡硝酸纤维素膜并干燥结合脱脂奶粉进行封闭,显色效果最佳。此外选择适当的培养基厚度可有效消除边缘效应。提示血清预处理、异丙基-β-D硫代半乳糖苷的加入方式、不同封闭条件及培养基厚度等因素,在利用抗原血清学识别的重组表达克隆技术进行抗原筛选中起关键作用。

TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因的识别

目的:应用重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)筛选与识别短暂性脑缺血发作(TIA)血清相关性抗原基因.方法:采集19例TIA患者血清,免疫筛选人主动脉内皮细胞cDNA表达文库;对阳性靶抗原行单克隆扩增,经单克隆内切除后转换载体pBluescript SK(+)提取质粒;对包含cDNA插入目的基因片段的质粒进行DNA序列检测,通过NCBI-BLAST同源性检索,鉴定具有免疫原性的独立的TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因.结果:(1)SEREX筛选出172个重组cDNA阳性单克隆;(2)单克隆内切除后获得167个pBluescript质粒,酶切鉴定质粒中均包含有目的基因插入片段;(3)生物信息学分析:识别11个独立的重组cDNA表达克隆抗原基因.(4)基因功能解析:发现matrix metalloproteinase 1(MMP1)、chromobox homolog 1(CBX1)和chromobox homolog 5(CBX5)与TIA和脑梗死(CI)的发生、发展关系密切.结论:应用SEREX技术成功筛选及鉴定出TIA相关靶抗原基因,发现MMP1、CBX1和CBX5可能与短暂性脑缺血发作(TIA)和脑梗死(CI)发生发展有关.

重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肿瘤抗原的研究进展

1995年Sahin等首先建立了重组cDNA表达文库血清学分析法 (SEREX)以来 ,大量的人类肿瘤抗原被发现和鉴定 ,并建立了SEREX技术合作组及相应的数据库。

乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆及序列分析

目的克隆并鉴定乙型肝炎病毒表面抗原基因,为下一步构建该重组腺病毒载体以及进一步研究腺病毒载体的包装及在乙型肝炎病毒基因治疗中的作用。方法参照人 HBV adr 亚型序列,设计和合成 S 基因特异引物。应用 PCR 技术,从含有 HBsAg 的 HBV DNA 中扩增目的 DNA,通过 TA 连接将其克隆人 pGEM-T easy 载体,经限制性内切酶 BglⅡ/SalⅠ鉴定后,进一步测序鉴定。结果从乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)血清中成功提取 HBV DNA,并以此 DNA 为模板,成功扩增出 S 基因,测序结果与 GenBank 中注册的相应序列比对,核苷酸序列的同源性高达92％～99％,预测氨基酸序列同源性亦达82％。结论从 HBsAg 阳性血清中成功克隆出 S 基因序列,为进一步构建重组腺病毒及后续实验奠定了基础。

单克隆抗体(McAb)的应用前景(续)

(二)临床诊断方面 1.在肿瘤学上的应用 McAb的问世,使肿瘤学家突破了长期用常规抗血清进行研究的局限性,并使抗体的应用范围愈益广泛,特别是在诊断和治疗肿瘤方面。现已制备出针对黑色素瘤、平滑肌瘤、骨肉瘤、肺癌、胃癌、直肠癌、胰腺癌、神经母细胞癌、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤等的McAb。

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体（TP）全基因序列的解析，通过重组技术已制备多种重组Tp抗原，并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发，但对于哪一种Tp蛋白抗原亿临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析，选取抗原性较啦的Tp外膜蛋白Gpd进行克隆表达。并以重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA法，评价其在悔毒血清学诊断中的应用价值。

我国结核抗体研究十六年回顾

1976年Nassau等首先将酶联免疫吸附试验(ELISA)用于血清结核抗体检测获得成功,把结核病血清学诊断又推向一个新高潮。我国于1978年引进ELISA技术,1983年起在结核病实验室诊断中应用。至今的十六年中,结核抗体研究取得了很大进展。

宫内感染乙型肝炎病毒儿童白细胞介素12转录研究

目的 探讨外周血单个核细胞白细胞介素 12 (IL-12 )P40转录变化和宫内感染乙型肝炎病毒 (HBV)免疫失败的关系。方法 采用体外细胞培养和半定量RT PCR技术对 2 5例宫内感染免疫失败儿童、8例宫内感染有效儿童及19名正常免疫儿童外周血单个核细胞在丝裂原 (植物血凝素和细菌酯多糖 )、酵母重组乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)及无刺激物时IL-12P40mRNA转录水平进行检测。结果 IL 12P40mRNA丝裂原刺激时转录在免疫失败组高于免疫有效儿童 (P =0 .0 42 ) ,自发转录和血清丙氨酸转氨酶水平呈显著正相关 (r =0 .3 89,P =0 .0 0 4)。在小剂量HBsAg刺激时 ,对照组、有效组和免疫失败组转录差异不明显。和小剂量HBsAg刺激时比较 ,大剂量HBsAg刺激时对照组表现为转录显著增加 (P =0 .0 3 9) ,有效组和免疫失败组变化不明显。结论 宫内感染HBV儿童对特异性抗原刺激IL-12反应低下可能是导致免疫失败的机制之一 。

梅毒螺旋体多表位重组抗原的研制及其应用

TP是一种严重威胁人类健康安全的病原体，其诊断方法主要有甲苯胺红不加热血清试验、快速血浆反应素试验、螺旋体血球凝集素试验、梅毒螺旋体明胶凝集试验等。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用基因工程技术表达梅毒螺旋体包膜蛋白作为诊断性抗原，应用于梅毒感染的诊断，取得了良好的效果。本研究分析选取梅毒螺旋体膜蛋白TpN15、TpN17、TpN44．5和TpN47最主要的优势抗原表位，经串联设计后运用基因工程技术表达梅毒螺旋体多表位重组抗原，并以之为基础，建立ELISA双抗原夹心法，用以临床检测梅毒感染。

肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选

目的筛选肺癌抗原组中强免疫原性抗原,以期为肺癌的早期诊断、疫苗研制提供参考。方法选取5份异体肺癌患者血清以重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术筛选肺癌cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。此外,选取2017年2月至2018年2月收治的肺癌患者60例为肺癌组,另取同期进行体检的正常人员60例为对照组。分别采集两组人员血清标本,对比相关肺癌抗原的异体血清反应结果。并对差异有统计学意义的肺癌抗原进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,明确其在肺癌早期诊断中的价值。结果本实验共完成3轮血清学筛选,最终得到70个阳性克隆。采用NCBI网上序列分析软件BLAST对各cDNA序列的同源性进行比对,结果显示上述70个阳性克隆分别表示63个不同基因,包括35个已知基因、26个功能未知基因以及2个新基因。其中35个已知基因中仅有DNA拓扑异构酶Ⅱα(Top2A)基因与肺癌相关,2个新基因分别为热休克蛋白90α(HSP90α)、真核翻译延长因子1γ(EF-1γ),功能未知基因中可能与肺癌相关的包括二羟基苯甲酸内置结合蛋白1配偶体(POB1)、中枢神经系肽酶Ⅰ(TPP1),共5种肺癌相关抗原。肺癌组Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆的IgG血清抗体阳性率高于对照组(P<0.01)。Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆联合检测诊断肺癌的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述三项指标单独检测(P<0.05)。结论SEREX技术可用于肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选、鉴定,临床工作中可将Top2A、HSP90α、POB1基因作为肺癌早期诊断以及免疫治疗的靶向基因。