CD_(34)^+造血干细胞混合CD_3^+ T细胞移植分离移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应

目的 探讨在异基因造血干细胞移植中能否采用纯化 CD34 + 造血干细胞混合一定量纯化 CD3+ T细胞移植达到既控制移植物抗宿主病 (GVHD)又保留移植物的抗白血病效应 (GVL )。 方法 (C5 7BL /6× 6 15 ) F1代接种 L 6 15白血病细胞株建立小鼠白血病模型作为移植受鼠 ,利用免疫磁珠纯化骨髓 CD34 + 造血干细胞及脾脏CD3+细胞 ,流式细胞仪分析纯化前后 CD34 +、CD3+细胞百分比 ,观察单纯移植 CD34 +细胞及混合不同数量级 CD3+细胞后受鼠生存时间、GVHD、GVL效应 ,移植后骨髓造血重建细胞来源。 结果 纯化 CD34 + 细胞 1× 10 6 移植组10 0 %死于白血病复发 ;CD34 +细胞 +纯化 CD3+细胞 (1× 10 7)移植组生存期明显延长 ,5 0 %死于白血病复发 ,无GVHD表现 ;CD34 + 细胞 +CD3+ 细胞 (5× 10 7)移植组长期存活 ,无白血病复发 ,无 GVHD表现 ;CD34 + 细胞 +CD3+细胞 (1× 10 8)移植组 6 2 .5 %死于 GVHD,37.5 %长期存活 ;CD34 + 细胞 +CD3+ 细胞 (1.5× 10 8)移植组 10 0 %死于GVHD。移植后生存时间 >6 0 d的受鼠骨髓造血重建细胞 y染色体检出率为 10 0 %。 结论 移植物中 CD3+细胞数量与 GVHD和 GVL效应密切相关 ,通过限定移植物中的 CD3+ 淋巴细胞的含量能够保留

抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体在小鼠体内性质的研究

目的:研究抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体的体内作用。方法:125I标记抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体采用氯胺T法,并采用昆明鼠和人K562耐药裸鼠移植瘤模型分别测定该微型双功能抗体在小鼠体内的药代动力学和体内组织分布;采用人K562耐药及敏感裸鼠移植瘤模型测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性及其不良反应。结果:抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体在昆明鼠体内的半衰期为2h;尾静脉注射抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体6h后,其在肿瘤部位的分布高于其他组织,在12h和24h时,其在肿瘤与血液分布的比率分别为2.69和8.09;抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体能介导人T细胞有效杀伤表达Pgp抗原的K562耐药细胞。结论:抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体能在裸鼠皮下人白血病细胞移植瘤部位富集,并能有效地抑制耐药白血病移植瘤的生长,无明显的不良反应。

自体及异体CD3单克隆抗体激活杀伤细胞对正常造血细胞的影响

为探索自体及异体CD3单克隆抗体激活杀伤 (CD3AK)细胞对正常造血细胞的影响 ,以固化抗CD3单克隆抗体联合小剂量IL 2诱导CD3AK细胞。采用流式细胞术 (FCM )检测CD3AK细胞的表型变化 ,并检测正常骨髓经与自体或异体CD3AK细胞培养后CD34+ 细胞的比例变化 ,用集落培养检测正常骨髓经与自体或异体CD3AK细胞共同培养后CFU GM的计数变化。结果显示 :3- 5 μg ml固化抗CD3单克隆抗体联合 10 0U mlIL 2可有效地激活CD3AK细胞 ;正常骨髓与异体CD3AK细胞培养 6小时后CD34+ 细胞的比例下降 32 .37%,正常骨髓与自体CD3AK细胞共同培养 6小时后CD34+ 细胞比例升高 5 .4 9%;CFU GM集落培养显示正常骨髓与异体CD3AK细胞共同培养 6小时后CFU GM的计数下降 2 0 .4 4 %,而正常骨髓与自体CD3AK细胞共同培养后CFU GM的数量下降 3.39%。上述结果表明 ,异体CD3AK细胞与正常骨髓造血细胞短期共同培养可产生一定的抑制作用 ,自体CD3AK细胞与骨髓造血细胞短期共同培养无明显影响。

混合脐血血浆用于CD3AK细胞培养的研究

目的 :观察比较混合脐血血浆和成人 AB血清在 CD3AK细胞培养中的作用效果。方法 :分别用混合脐血血浆和成人 AB血清培养 CD3AK细胞 ,检测两组细胞的增殖特性、杀伤活性及免疫表型。结果 :混合脐血血浆组的增殖倍数略低于血清组 ,对 K5 6 2、HL - 6 0的杀伤活性则稍高于血清组 ,但差异均无显著性意义 (均为 P >0 .0 5 ) ;两组的免疫表型都以 CD3+、CD8+为主 ,亦无显著性差异 ( P >0 .0 5 )。结论 :混合脐血血浆在 CD3AK等免疫效应细胞的培养中可能和成人

抗CD_3-抗CD_(20)微型双功能抗体的优化表达及其生物活性分析

目的探讨抗CD3-抗CD20微型双功能抗体的优化表达条件及其生物学活性,为细胞免疫治疗提供依据。方法在不同培养基及不同浓度诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)中表达抗CD3-抗CD20微型双功能抗体,用亲和层析法纯化该产物并经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,用流式细胞仪(FACS)法测定其双功能活性。结果IPTG浓度为400μM,培养基选用2YT时目的蛋白实现可溶性表达,培养表达量可达3.5 mg/L,其纯度较高,且与Jurkat和Daudi细胞均具有很好的结合活性。结论本研究优化了抗CD3-抗CD20微型双功能抗体表达条件,且表达产物具有双功能活性;此为细胞免疫治疗奠定了基础。

ATG与抗CD3单克隆抗体在肾移植免疫诱导治疗中的比较研究

[目的]比较抗人体胸腺细胞球蛋白（ATG）与抗CD3单克隆抗体在肾移植免疫诱导治疗中的效果。[方法]对比分析应用ATG（77例）与抗CD3单克隆抗体（24例）进行免疫诱导治疗的肾移植患者的临床资料。[结果]ATG组与抗CD3单克隆抗体组在术后1年急性排斥反应发生率、透析过渡比例、早期移植肾功能恢复、年人／肾存活率方面无显著性差异，而ATG组药物不良反应及术后继发感染率显著少于CD3单克隆抗体组（P〈0．05）。[结论]身体一般情况较好的患者可以考虑用抗CD3单克隆抗体治疗，而耐受力较差或老年患者宜使用ATG治疗以策安全。

CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞原代细胞 白血病体外净化效应

本研究旨在探讨免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞白血病(CML)原代白血病 细胞的体外净化效应。培养并扩增PA317/iNOS细胞并用G418筛选;用NIH3T3细胞测定病毒滴度,分离外周血 单个核细胞并用抗CD3单克隆抗体激活;病毒感染靶细胞CD3AK及用G418筛选,用逆转录-聚合酶链反应 (RT PCR)检测CD3AK/iNOS中iNOScDNA的转录;用硝酸还原酶法检测CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含 量以及iNOS活性;用系列稀释半定量巢式RT PCR检测CML患者白血病原代细胞经CD3AK/iNOS细胞净化后 bcr/abl融合基因的表达水平。结果表明,PA317/iNOS细胞能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒;NIH3T3细胞 测定病毒滴度为1.0×105CFU/ml;RT PCR检测发现CD3AK/iNOS细胞中有iNOScDNA的转录;CD3AK/iNOS 细胞培养上清中NO含量和iNOS活性较CD3AK细胞明显升高。上述两项指标,经统计学检验,均有显著性差异 (P<0.001,P<0.001)。系列稀释半定量RT PCR检测发现,经CD3AK/iNOS细胞净化后CML患者白血病细胞 bcr/abl融合基因的表达明显下调。实验结果统计分析表明,CD3AK/Neo细胞组净化后与CD3AK/iNOS细胞组净 化后bcr/ablmRNA表达的比较具有显著性差异(P<0.001)。结论:逆转录病毒可介导iNOS基因转入CD3AK细 胞,成功地构建了CD3AK/iNOS;CD3AK/iNOS能明显地增加NO含量和iNOS活性,应用CD3AK/iNOS可能成 为一个有效的AHSCT体外净化方法。

脐血CD_3AK细胞和其培养上清诱导HL-60凋亡

目的:探讨脐血CD_3AK细胞和其培养上清(CM)诱导HL-60细胞凋亡的作用。方法:用细胞形态学观察,DNA琼脂糖电泳,原位末端标记法分别检测出HL-60自然凋亡与CD_3AK细胞诱导和CM诱导的HL-60细胞凋亡率。结果:HL-60细胞自然凋亡率为(4.60±2.17)%;CD_3AK细胞诱导HL-60细胞凋亡率为(21.35±4.46)%(t=6.80,P<0.01),CM诱导的HL-60细胞凋亡率为(33.08±5.12)%(t=8.26,P<0.01)。结论:脐血CD_3AK细胞和其培养上清能诱导HL-60凋亡。

肝癌不同发展阶段大鼠肝组织CD^(3+) CD^(8+) CD^(20+)细胞表达的实验研究

目的探讨CD3+、CD8+、CD20+细胞在二乙基亚硝胺(DEN)造模大鼠肝硬化、肝癌、肝癌肺转移3个阶段肝组织中的数量及意义。方法 DEN制备肝硬化、肝癌、肝癌肺转移大鼠模型,免疫组织化学(SP)法进行CD3、CD8、CD20染色,对阳性细胞进行定量分析。结果 CD3+细胞平均数从高到低为:肝癌组织、肝癌肺转移组织、肝硬化组织、正常肝组织(P<0.05);CD8+细胞平均数从高到低为:正常肝组织、肝硬化组织、肝癌组织,肝癌肺转移(P<0.05);CD20+细胞平均数从高到低为:肝癌组织、肝癌肺转移、肝硬化组织、正常肝组织(P<0.05)。结论在DEN制备的大鼠模型中,随着肝组织进一步恶化,CD3+、CD20+细胞逐渐增多,CD8+细胞却减少,导致肿瘤微环境免疫状态的紊乱。

结直肠癌组织CD3免疫组织化学评分与肿瘤分化程度及预后关系分析

目的分析结直肠癌组织CD3免疫组织化学评分与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期、组织抗原表达及血清肿瘤抗原关系,评估CD3免疫组织化学评分在结直肠癌免疫状态评估中的作用。方法采用免疫组织化学方法对116例结直肠癌患者肿瘤标本进行CD3免疫组织化学染色并评分,将患者分成CD3低表达组与CD3高表达组。比较分析两组患者的性别和年龄组成、肿瘤分化程度及pTNM分期。同时比较两组肿瘤组织样本CEA、EGFR、MUC1、HER2、mesothelin、PD-1、PD-L1及FOXP3免疫组织化学评分,并且比较两组患者血清中CEA、CA125及CA199水平。结果174例组织标本CD3免疫组织化学染色均可见阳性细胞,评分均在1~12分之间。CD3低表达组年龄<30岁患者比例(9.20%)高于CD3高表达组(0%),>65岁患者比例(33.33%)低于高表达组(57.47%)。CD3低表达组高分化癌(3.45%)及中分化癌(60.92%)比例低于CD3高表达组(分别为9.20%和74.71%),而低分化癌(27.59%)及复发/转移癌(8.05%)比例高于CD3高表达组(分别为9.20%和6.90%)。pTNM分期越高预后越差,CD3免疫组织化学评分越低(P<0.05)。CD3低表达组患者组织样本中PD-1(P<0.001)、PD-L1(P<0.001)及FOXP3(P<0.01)水平低于CD3高表达组,而两组患者血清肿瘤标志物(CEA、CA125和CA199)水平无明显差异。结论CD3免疫组织化学评分可广泛应用于结直肠癌肿瘤组织,并反映患者的肿瘤相关免疫状态与预后。

SCD30检测在肾移植中的应用进展

肾移植后的急性排斥反应及慢性移植肾病是影响移植肾长期存活的重要因素,如何早期诊断和预防仍然是目前的研究重点,SCD30是一种新型高效的检测指标,本文就其在肾移植中的作用加以综述。

Graves病不同阶段病程中CD3^-CD19^+B细胞含量变化

目的探讨CD3-CD19+在Graves病(GD)各阶段病程中的含量变化及临床意义。方法采用流式细胞术检测GD未治疗组(初发组)、甲状腺缓解组、完全缓解组、复发组及正常对照组CD3-CD19+比值,将各组结果进行统计学分析。结果初发组结果明显高于正常对照组、缓解组、完全缓解组及复发组,差异有统计学意义(P分别为0.002、0.023、0.002、0.026),其余各组别比较虽有差异,但没有统计学意义。结论 CD3-CD19+的结果与GD整个病程的免疫反应相一致,体液免疫反应在GD病程中都起到很重要的作用,CD3-CD19+结果对GD各阶段病程的诊断、治疗及预后有临床意义。

Graves病治疗前后CD3^-CD56^+的变化及临床意义

目的检测CD3-CD56+在Graves病治疗前后变化,探讨NK细胞在治疗过程中的变化及ADCC效应对Graves的影响或作用。方法选取正常对照组22例,Graves病初次发现且未治疗病人33例,抗甲状腺药物(ATD)治疗后缓解患者30例,完全缓解患者12例,及复发患者11例,用流式细胞术检测CD3-CD56+的比值。结果正常对照组结果为7.03±3.91,初发组结果为4.83±2.72,缓解组结果为5.12±3.19,完全缓解组结果为7.91±4.05,复发组结果为6.97±3.28;初发组及缓解组结果低于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.018,P=0.043),初发组结果明显高于完全缓解组,差异有统计学意义(P=0.007);缓解组结果低于完全缓解组,差异有统计学意义(P=0.016)。结论 Graves病CD3-CD56+低于正常,ADCC效应及NK细胞的其他免疫功能有可能受到损害或限制,破坏体内的免疫平衡或免疫功能紊乱。CD3-CD56+结果对Graves各阶段病程的诊断、治疗及预后有临床意义。

抗EGFR/CD3双特异性抗体的制备与功能的初步研究

目的构建抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)和抗CD3(anti-CD3)的双特异性抗体(anti-EGFR/CD3),并在体外初步评价其杀伤肿瘤的功能。方法通过基因工程技术,利用knobs-into-holes模式分别构建表达anti-EGFR-HC-knob、anti-EGFR-LC和anti-CD3-scFV-HC-hole的载体,共同转染Expi 293F细胞,表达双特异性抗体,依次用抗体特异的亲和层析和分子排阻层析进行纯化,再用流式细胞仪和实时无标记细胞功能分析仪评价其体外结合能力和体外肿瘤杀伤功能。结果成功获得较高纯度的抗体。流式细胞仪体外结合实验结果显示,双特异性抗体能够同时与EGFR+的U87Ⅷ脑胶质瘤细胞系、HCT-116结肠癌细胞系和CD3+的Jurkat T淋巴瘤细胞系结合,具有2种抗体的功能,同时还能很好地激活T细胞(P<0.000 1);在体外杀伤效果方面,双特异性抗体作用后杀伤效果明显高于其他抗体和对照组(均为P<0.000 1),具有很好的杀伤效果。结论用knobs-intoholes技术获得的anti-EGFR/CD3具有较好的生物活性,为双特异性抗体的肿瘤免疫治疗奠定了一定的基础。

活化脐血T细胞和NK细胞的抗原及细胞因子表达研究

目的 :比较γIL - 2及抗 CD3m c Ab+γIL - 2对脐血单个核细胞 (MNC)的免疫表型及细胞因子的影响。方法 :采用间接玫瑰花结法实验测定 2 3例脐血 MNC表面的分化抗原 ,EL ISA双抗夹心法测定肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)、白介素 - 6 (IL - 6 )、白介素 - 8(IL - 8)。结果 :经γIL - 2及抗 CD3mc Ab+γIL - 2激活的脐血 MNC其分化抗原发生明显变化。 1、两组与未活化相比 :CD3+ 、CD8+ 、CD16 + 、CD5 6 + 、CD19+ 、CD2 3+ 、HL A- DR↑ ,其表达 CD2 5亦均增加 ,但抗 CD3mc Ab+ γIL- 2激活组 >γIL- 2组 (P<0 .0 1) ,CD45 RA+均明显下降 ,但两组差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,CD34+无明显改变。 2、经抗 CD3m c Ab+ γIL- 2激活的 MNC,细胞集落增加 ,但 γIL- 2组无此作用。 3、细胞因子的改变 ,无论经 γIL- 2还是抗 CD3m c Ab+ γIL- 2激活的脐血 MNC上清液 ,其 IL- 6增高 ,但差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,TNF- α,IL- 8亦明显增高 ,但抗 CD3m c Ab组 >γIL- 2组 (P<0 .0 1)。结论 :脐血抗 CD3激活的杀伤细胞 (CD3AK)比 γIL- 2激活的L AK毒性作用更强 ,更有利于杀伤肿瘤细胞。

乙型肝炎相关肝癌患者乙型肝炎病毒不同抗原肽特异性CD3＋CD8＋人白细胞抗原-A2＋细胞表达

目的探讨乙型肝炎相关肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMc）中HBV不同抗原肽特异性CD3＋CD8＋人白细胞抗原（HLA）-A2＋细胞的表达。方法从4例HLA-A2阳性乙型肝炎相关HCC患者外周血中分离PBMC，分别与HBV抗原肽sAg（FLLTRILTI、GLSPTVWLSV、WLSLLVPFV），HBVcore（FLPSDFFPSV）和HBVpol（FLLSLGIHL）及抗一CD3一pacific blue、抗-CD8-异硫氰酸荧光素共育，流式细胞仪分析HBV／HLA—A2-CD3-CD8阳性细胞，克隆培养，筛选出克隆培养的抗HBVT淋巴细胞；再与含有HBV的肝癌细胞株HepG2（HLA-A2^＋）共育，ELISA法检测其分泌IFN-γ水平。结果4例患者体内受GLSPTVWLSV肽诱导的特异性抗HBVT淋巴细胞占所有CD8^＋细胞的1．44％±0．04％，高于FLLTRILTI肽的0．68％±0．08％、FLPSDFFPSV肽的1．06％±0．09％、FLLSLGIHL肽的0．56％±0．04％和WLSLLVPFV肽的0．46％±0．08％（t=0．001，P〈0．05）。将GLSPTVWLSV／HLAA2获得的HBV／HLA-A2 Pentamer-CD3-CD8阳性细胞克隆，获得2株抗HBVCD8T淋巴细胞，与负荷GLSPTVWLSV肽段的HepG2（HLA-A2＋）细胞共育，CD8T淋巴细胞分泌较高水平的IFN-γ。结论乙型肝炎相关HCC患者外周血中存在针对不同HBV抗原肽的特异性抗HBVCD8T淋巴细胞，其表达量与抗原肽段有关。

支气管肺炎患儿T淋巴细胞亚群变化情况及临床意义

目的研究支气管肺炎患儿外周血T淋巴细胞亚群变化及其临床意义。方法采用免疫荧光流式细胞技术检测了48例支气管肺炎患儿及40例正常儿童外周血T淋巴细胞亚群CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞水平。结果支气管肺炎患儿CD3+和CD3+CD4+T细胞百分比明显低于正常对照组,分别为(64.12±6.89)%和(70.11±5.09)%(P<0.01)、(26.94±6.24)%和(34.92±6.40)%(P<0.01);而CD3+CD8+T细胞百分比分别为(30.25±6.03)%和(24.47±3.89)%,观察组明显高于对照组(P<0.01)。结论支气管肺炎患儿T淋巴细胞亚群比例改变,提示支气管患儿存在免疫功能异常,为支气管肺炎患儿临床免疫治疗提供理论依据。

红细胞在外周血单个核细胞活化过程中对细胞因子分泌的影响

目的 通过检测外周血单个核细胞（PBMC）培养液中细胞因子IFN-γ、TNF—α、IL-1β的浓度，观察和分析红细胞在抗CD3单克隆抗体（CD3McAb）诱导PBMC活化过程中对细胞因子分泌的影响，为临床在分离PBMC进行自体淋巴细胞免疫治疗的应用过程中取舍红细胞数量多少为宜提供实验依据。方法 获取健康成年人PBMC，采用人工方法加入不同数量的红细胞，模拟在制备PBMC过程中残余的红细胞数量，然后根据红细胞数量与PBMC中细胞数量之比的不同组成3个不同的实验组（RBC／PBMc=2：1、10：1、50：13组），同时附设单独PBMC为对照组。利用CD3McAb分别对以上4组细胞进行激活，然后检测各组细胞培养液中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的含量。结果 随着红细胞加入数量的增加，细胞培养液中各细胞因子的浓度有不同程度的上升，具有统计学意义，并且与加入的红细胞数量呈正相关关系。结论当RBC／PBMC≤50：1时，红细胞在CD3McAb诱导PBMC活化过程中对细胞因子IFN-γ，TNF—α、IL-1β的分泌具有一定的促进作用。

化疗对中晚期非小细胞肺癌患者淋巴细胞亚群的影响

目的探讨NSCLC患者在化疗前后淋巴细胞亚群含量的变化及临床意义。方法采用流式细胞仪技术,分别对治疗组和对照组外周血淋巴细胞亚群进行检测计数。结果 76例NSCLC患者CD3+、CD4+、NK细胞的数量以及CD4+/CD8+比值均明显低于健康人群,其CD8+细胞的比例明显高于健康人群,差异具有统计学意义(P<0.05)。化疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK较化疗前升高(P<0.05);CD8+化疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NSCLC患者机体的免疫状态与病情发展、临床分期密切相关,化疗可明显改善NSCLC患者机体的免疫功能。

慢性乙型肝炎患者外周血Treg/Th17检测及其意义

目的通过观察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血Treg、Th17细胞及其相关细胞因子的变化,探讨淋巴细胞亚群Treg和Th17细胞在CHB发病机制中的作用。方法采用流式细胞术检测70例CHB患者(CHB组)和20例健康体检者(对照组)外周血中Treg(CD4+CD25highCD127lowT)和Th17(CD3+CD8-IL-17+T)细胞频数;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-10、TGF-β1、IL-17及IL-23水平。结果 CHB组外周血中Treg、Th17细胞频数及其相关因子IL-23、IL-10、TGF-β1水平均明显高于对照组(P<0.05),但IL-17升高不明显(P>0.05)。CHB组Treg/Th17比率明显低于对照组(P<0.05),且轻中度CHB组Treg/Th17比率及TGF-β1水平明显低于重度CHB组(P<0.05)。结论 CHB患者外周血中存在Treg/Th17失衡;Treg/Th17失衡可能参与了CHB的发生发展。