大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。

酚氧化酶处理对白肋烟化学成分和烟叶品质的影响

为探索酚氧化酶处理在提升白肋烟烟叶品质方面的可行性,以未经醇化的湖北恩施白肋烟片烟为研究材料,将酚氧化酶施用于烟叶表面,研究了其在不同温度、酶液施加量及处理时间下对白肋烟烟叶内在化学组分及品质的影响。结果表明,酚氧化酶能够促进白肋烟中多种化学组分的改变,包括降低烟叶中特有亚硝胺(TSNAs)类和酚类物质含量,并促进酯类物质的积累。此外,酚氧化酶对烟叶中总糖及还原糖、总植物碱及酮类物质的作用效果受到处理条件的显著影响。在50℃、20%酶液添加量下施用酚氧化酶24 h后,烟叶中的TSNAs、酚类致香物质和酮类致香物质含量分别降低20.04%、27.08%和21.29%,还原糖、总糖、酯类致香物质含量分别增加44.92%、29.02%和11.27%,白肋烟的香气质、香气量、杂气、浓度、刺激性等多个指标分值提升1分以上,烟叶品质得到改善。综上,酚氧化酶施用于未经醇化的白肋烟叶,能够快速改善烟叶内在化学组分和提升烟叶品质。

灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶活性的高光谱研究

利用高光谱技术实现灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶(PPO)活性的快速无损检测。为了使预测效果更好,在900~1700 nm光谱范围内采集253个健康花椰菜样本及257个染病花椰菜样本的光谱信息,并使用分光光度计法对样本中多酚氧化酶活性进行测定。对健康及染病花椰菜样本PPO活性均值进行分析,发现健康花椰菜PPO活性均值(10.257 U·g^(-1))小于染病花椰菜PPO活性均值(12.324 U·g^(-1))。利用光谱-理化值共生距离(SPXY)算法对样本进行校正集(健康样本193个,染病样本197个)和预测集(健康样本60个,染病样本60个)的划分,对划分后的样本集进行六种单一预处理(卷积平滑算法SG、去趋势算法DT、中值滤波MF、归一化处理NOR、标准正态变量变换SNV、基线校正Baseline)。利用相关系数(R)和均方根误差(RMSE)作为模型评价指标,发现预处理能够有效提高模型的精度和稳定性,其中健康样本经NOR预处理后的预测集建模效果最好;染病样本经DT预处理后的预测集建模效果最好。采用连续投影算法(SPA)与回归系数法(RC)提取特征波长,建立PPO活性值的偏最小二乘回归(PLSR)、最小二乘支持向量机(LS-SVM)及BP神经网络三种预测模型,探究不同特征波长提取方法对模型精度的影响,比较不同建模方式对花椰菜PPO活性预测的准确度。结果说明提取特征波长可以优化光谱信息,SPA和RC对两种样本提取的波长个数分别为9,12,7和11,其中SPA优化后的光谱数据对健康样本PPO活性预测效果较好,RC优化后的光谱数据对染病样本PPO活性预测效果较好。对比分析模型效果,发现LS-SVM模型对两种样本和其对应的酶活性产生了很好的拟合效果。最终发现,SPA-LS-SVM模型对于健康花椰菜PPO活性预测效果较好,其预测相关系数(Rp)为0.832,预测均方根误差(RMSEP)为1.676;RC-LS-SVM模型对于染病花椰菜PPO活性预测效果较好,其Rp为0.848,RMSEP为1.156。研究结果表明高光谱技术可以实现灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶活性的测定,为快速检测花椰菜多酚氧化酶活性及便携式仪器开发提供了科学依据。

中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase,PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2.0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing,AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为:GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。

梭鱼草叶片抗氧化酶、抗坏血酸-谷胱甘肽循环与乙二醛酶系统对铅胁迫的响应

为了探明梭鱼草叶片细胞应对Pb^(2+)胁迫的生理机制,研究以液培法考察了不同浓度Pb^(2+)胁迫下梭鱼草叶片丙二醛(MDA)与叶绿素含量,以及抗氧化酶活性、抗氧化剂含量和乙二醛酶系统的变化规律。结果表明,(1)5.0 mg/L Pb^(2+)胁迫第14天和第21天时,梭鱼草叶片叶绿素含量,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性,抗坏血酸(AsA)、脱氢抗坏血酸(DHA)、谷胱甘肽(GSH)、非蛋白巯基总肽(NPT)和植物螯合肽(PCs)等抗氧化剂含量没有发生明显变化;第21天时叶片细胞中甲基乙二醛(MG)含量显著增加,而MDA含量无明显增加。(2)10.0 mg/L Pb^(2+)处理至第21天时,梭鱼草叶片MDA、MG、GSH及NPT含量及过氧化物酶(POD)活性明显增加,而脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、甲基乙二醛酶Ⅱ(GlyⅡ)活性呈相反变化趋势。(3)在15.0 mg/L Pb^(2+)处理期间,梭鱼草叶片MDA含量显著增加,其GSH、NPT、PCs被诱导合成以螯合细胞中过量积累的Pb^(2+);同时叶片POD、SOD、APX活性和AsA含量显著增加。15.0 mg/L Pb^(2+)处理第21天时,乙二醛酶系统已经不能缓解高浓度Pb^(2+)胁迫诱发的羰基胁迫。可见,梭鱼草叶片对5.0 mg/L Pb^(2+)具有良好的耐受性;在较高浓度(≥10.0 mg/L)Pb^(2+)胁迫下,梭鱼草叶片细胞膜脂过氧化作用加剧,此时其主要通过合成非蛋白巯基化合物、增加抗氧化酶活性及AsA含量来减缓氧化损伤;本试验条件下梭鱼草叶片乙二醛酶系统没有表现出明显的解毒作用。

棉酚对雄性肉仔鸡脏器指数和血清氧化酶活性的影响

试验旨在研究棉酚对不同生长阶段雄性肉仔鸡脏器指数及血清氧化酶活性的影响,选择1日龄48只雄性肉仔鸡,随机分为4组,即C组(对照组)、L组、M组、H组,每组4个重复,每个重复3只鸡。各组在饲喂基础日粮基础上根据体重每天分别灌入蒸馏水和100、150、200 mg/kg棉酚。试验期3周。结果显示:与C组相比,8日龄及13日龄试验组肉仔鸡肝脏指数均极显著升高(P<0.01);8日龄M组、13日龄H组和18日龄L组肉仔鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05);13日龄M组肉仔鸡肾脏指数显著升高(P<0.05),H组肉仔鸡肾脏指数极显著升高(P<0.01)。8日龄M组、H组以及18日龄L组肉仔鸡法氏囊指数显著升高(P<0.05)。随着棉酚剂量增加,肉仔鸡血清丙二醛(MDA)的含量逐渐升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)逐渐降低,机体抗氧化能力下降。试验组肉仔鸡肝脏发生明显病变,出现肝脏细胞间隙变大、分布杂乱不整齐、肝脏细胞结构不完整和细胞膜溶解等病理特征。研究表明,灌喂100 mg/kg以上剂量的棉酚可影响雄性肉仔鸡肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊的脏器指数,引起机体的氧化应激反应,降低其抗氧化能力,对肝脏造成损伤。

褐变抑制剂对果蔬多酚氧化酶的影响

果蔬贮藏过程中,褐变问题严重影响其经济价值及营养价值,由多酚氧化酶引起的酶促褐变备受关注,寻找合适的抑制方法是国内外研究的热点。一些化学抑制剂对于酶促褐变具有良好的抑制效果,本文综述了果蔬褐变的机理,抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸抑制剂的作用原理及具体应用,旨在为解决由酶促褐变引起的果蔬生产加工问题提供参考,促进果蔬品质的提升。

抗褐变抑制剂对果蔬多酚氧化酶的影响

果蔬的褐变问题对农户造成了很大的经济损失。在生产贮藏过程中,由于酶促褐变产生的对果蔬色泽、感官、及营养品质的负面影响大大降低了果蔬市场的经济效益。褐变是果实成熟老化生理衰退和果实品质劣变的特征之一,本质上是根据是否有酶的参与分为酶促褐变和非酶促褐变。

烤烟叶片多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性影响因素研究

研究了一些理化因素对烤烟叶片多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性的影响.结果表明,2种酶均较耐高温,但抗坏血酸氧化酶热稳定性好于多酚氧化酶.多酚氧化酶作用最适pH值为6,抗坏血酸氧化酶为5.Cu2+能增强多酚氧化酶活性,减弱抗坏血酸氧化酶活性.EDTA,NaHSO3,H3BO3,柠檬酸既是多酚氧化酶的良好抑制剂,又是抗坏血酸氧化酶的激活剂.

基于黄鲫蛋白肽制备南美白对虾多酚氧化酶复合生物抑制剂的研究

目的 以黄鲫蛋白肽(half-fin anchovy hydrolysate peptides,HAHp)为基料复配抗坏血酸和茶多酚制备南美白对虾多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)复合生物抑制剂(composite biological inhibitor, CBI)。方法 以南美白对虾PPO抑制率为检测指标,分别研究HAHp、抗坏血酸、茶多酚、柠檬酸和乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na)单独抑制PPO活性,选取HAHp、抗坏血酸和茶多酚进行三因素三水平正交优化实验优化CBI配方组成,通过酶促动力学研究CBI对南美白对虾PPO的抑制模式。结果 HAHp、抗坏血酸、茶多酚、柠檬酸和EDTA-2Na对南美白对虾PPO都有一定的抑制作用,且有一定的剂量依赖性,但单一抑制剂对PPO的抑制作用有限。HAHp与天然抗氧化剂抗坏血酸和茶多酚复配,经(L933)正交实验优化CBI的最佳配方为:0.7%HAHp、0.02%抗坏血酸和0.20%茶多酚。经测定CBI对南美白对虾PPO抑制率达到94.71%±0.46%,酶促动力学结果表明CBI是一种混合型抑制剂,通过降低南美白对虾PPO对底物亲和力实现抑制PPO活力。结论 以HAHp为基料复配抗坏血酸和茶多酚制备的CBI能够有效地抑制南美白对虾PPO活性,有望开发成一种防虾黑变的天然抑制剂,为南美白对虾天然保鲜剂的研究奠定了理论基础。

茶多酚和抗坏血酸对染石英粉尘大鼠血抗氧化酶活性的影响

探讨联合应用茶多酚、抗坏血酸对石英染尘大鼠血液中抗氧化酶一氧化氮合酶 (NOS)、超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -PX)活性的影响。大鼠染尘后 ,血液中NOS活性明显上升 ,SOD、GSH -PX活性却呈显著下降。应用茶多酚、抗坏血酸干预 30天后 ,血液中NOS活性显著下降 ,而SOD、GSH-PX活性明显上升。结论认为应用茶多酚和抗坏血酸可以提高石英染尘大鼠体内抗氧化酶活性。

4-HR与抗坏血酸对中华管鞭虾多酚氧化酶的抑制动力学模拟分析

研究无硫复合抑制剂主要作用成分4-己基间苯二酚(4-hexylresorcinol,4-HR)、抗坏血酸对中华管鞭虾多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)活性的抑制作用,并从抑制剂化学结构及动力学模型出发分析推断其抑制机理。结果表明,4-HR、抗坏血酸均能抑制PPO活力,且对酶促反应有延滞作用,两者半抑制浓度分别为0.072、2.02 mmol/L,对中华管鞭虾PPO的抑制作用都表现为竞争性抑制;化学动力学模拟分析显示4-HR、抗坏血酸均可与PPO双铜活性中心结合,其中4-HR可生成一种高稳定的多酚氧化酶络合物,持续有效地消耗PPO。4-HR、抗坏血酸均能有效抑制中华管鞭虾PPO酶促反应,其中4-HR抑制效果更显著。本实验为无硫复合抑制剂在海水虾捕捞与加工过程中的应用推广提供理论依据。

抗坏血酸衍生物抑制蘑菇的多酚氧化酶

生果蔬的酶褐变主要由天然的酚化合物转换成醌,醌再聚合成褐、红或黑的色素所致。通常参与这一系列反应的是多酚氧化酶(PPO),

抗坏血酸对铜胁迫下广藿香幼苗生长、铜积累和抗氧化酶活性的影响

通过室内水培试验,研究了外源添加抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)对铜(Copper,Cu)胁迫下广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)幼苗生长、Cu^(2+)积累和抗氧化酶活性的影响.结果显示,与对照相比,10—80μmol·L-1Cu^(2+)降低了广藿香幼苗的苗长、根长、植株生物量和根系耐性指数,且随Cu^(2+)浓度增大抑制作用增强.与Cu^(2+)胁迫相比,外源添加0.10—0.50 mmol·L^(-1)As A提高了广藿香幼苗的苗长、根长、植株生物量、根系耐性指数、根系活力以及SOD、POD、CAT和APX酶活性,降低其根系相对电导率、MDA含量和Cu^(2+)含量;随As A浓度的增加,苗长、根长、植株生物量、根系耐性指数、根系活力以及POD和CAT活性先升高后下降,相对电导率、MDA含量和Cu^(2+)含量先下降后上升,SOD和APX活性则一直增加.结果显示,外源添加0.25 mmol·L^(-1)的As A能提高广藿香幼苗细胞清除活性氧的能力,一定程度上缓解40μmol·L^(-1)Cu^(2+)胁迫对膜系统的伤害,减轻Cu^(2+)胁迫对广藿香幼苗生长的毒害作用.

植物抗坏血酸氧化酶的研究进展

抗坏血酸氧化酶在植物生理中具有重要的意义,不但与植物的生长发育和抗衰老有关,而且和果实的储藏有关。介绍了抗坏血酸氧化酶活性的测定方法;分析了影响抗坏血酸氧化酶活性变化的主要因素,认为抗坏血酸氧化酶的活性受到金属离子、有机无机小分子和外界环境条件等因素的影响;概述了农作物、果树和蔬菜关于抗坏血酸氧化酶活性的研究状况。采用不同的处理可以提高一些农作物的抗病性,延长果实的储藏期限,提高蔬菜种子的发芽率和一些子实体的使用价值。

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.

小麦抗坏血酸氧化酶活性与抗病性关系的初步探讨

通过测定小麦推广品种鄂恩 1号感病程度不同叶片的抗坏血酸氧化酶的活性 ,发现小麦感病叶片的酶活性明显高于不感病叶片 ,对 16个不同程度感染锈病、白粉病的小麦品种的抗坏血酸氧化酶活性的测定 ,结果表明 ,抗坏血酸氧化酶的活性随病情指数的增加而增强 。

抗坏血酸氧化酶在TRINDER反应中抗VC干扰应用评价

临床生化许多检测项目都应用了Ｔｒｉｎｄｅｒ反应，如葡萄糖（ＧＬＵ）、甘油三脂（ＴＧ）、胆固醇（ＣＨＯＬ）、尿酸（ＵＡ）。其原理为被测物质通过酶作用产生的过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）在４—氨基替比林（４－ＡＡＰ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）的存在下，可生成红色醌亚胺...

噪声对采后黄瓜中抗坏血酸氧化酶活性的影响

以采摘后的黄瓜为实验材料,选择不同分贝的噪声剂量对其进行处理,研究了噪声对抗坏血酸氧化酶活性的影响。实验结果表明,噪声会激化和提高采后黄瓜组织中抗坏血酸氧化酶活性,但噪声剂量超过95dB后,在作用初期会对该酶起到一定程度的钝化作用。在三种噪声剂量中,85dB的噪声对抗坏血酸氧化酶活性的影响较为显著。

植物中的抗坏血酸氧化酶

文章简要介绍植物中抗坏血酸氧化酶的结构、功能、基因的表达调控及其参与的生理反应研究进展。