藜麦抗坏血酸过氧化物酶基因(CqAPX)家族生物信息学与表达模式分析

为研究藜麦APX(CqAPX)基因结构和功能,利用生物信息学方法和公共数据库对CqAPX基因家族成员的理化性质、保守基序、基因结构和顺式元件以及表达谱进行分析。结果表明,CqAPX具有较高的进化保守性,可划分为4个类群。此外,CqAPX基因的启动子含有丰富的与胁迫相关的顺式作用元件,CqAPX基因在根、叶、花序和种子中组织特异性表达。干旱、盐和热胁迫处理能够显著改变CqAPX基因的表达。

不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。

抗坏血酸过氧化物酶基因转化苹果的研究

利用根癌农杆菌介导法对"嘎啦"苹果叶片进行遗传转化,获得"嘎啦"苹果的转基因植株。2d的预培养,OD600值约为0.6的工程菌液浓度,侵染时间10min,3d的共培养,延迟筛选10d获得较高的转化效率。PCR检测和Gus染色表明,APX基因已整合到苹果基因组中。

胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶基因的分离及其对非生物胁迫的响应

[目的]抗坏血酸过氧化物酶(APX)利用抗坏血酸作为电子供体,清除植物中的过氧化物,在植物应对非生物胁迫中起重要作用。本文目的是研究胡萝卜Dc APX基因在抵御逆境胁迫过程中的响应情况。[方法]以胡萝卜‘黑田五寸’为研究材料,克隆获得胡萝卜Dc APX基因(Gen Bank登录号为KR364573),对该基因进行序列分析,并研究其主要非生物胁迫(高温、低温、干旱和盐胁迫)下的基因表达情况。[结果]序列分析表明,胡萝卜Dc APX基因全长753个碱基,编码250个氨基酸,预估其蛋白质相对分子质量为27.76×103,p I值5.65。进化分析表明,胡萝卜Dc APX在进化关系上与同属伞形科的短果茴芹同源性最高。空间结构分析表明,胡萝卜Dc APX的氨基酸二级结构由38.40%的α-螺旋、10.40%的延伸主链和51.20%的随机卷曲构成。胡萝卜Dc APX的氨基酸三级结构由10个α-螺旋和4个β-折叠构成。实时荧光定量PCR结果显示,胡萝卜‘黑田五寸’中Dc APX基因表达具有组织特异性,在叶中表达量最高。[结论]胡萝卜中Dc APX基因可以响应多种非生物逆境胁迫,在胡萝卜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。

条斑紫菜抗坏血酸过氧化物酶基因的cDNA克隆和序列分析(英文)

利用细胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因部分片段为探针,从条斑紫菜(Porhyrayezoensis)叶状体的cDNA文库中筛选出1种新型的编码APX的全长cDNA克隆。该克隆开放阅读框编码242个氨基酸,与高等植物已知的胞质APX序列相似,同时具有两个特征性的保守区域。推导的氨基酸序列具有与在一种单细胞红藻(Galdieriapartite)中发现的APX B相似的杂交类型结构,这种结构可能是红藻或者非绿色光合生物的APX的重要特征。该cDNA克隆编码区G+C含量达到63 7%,其中密码子的第3位G+C含量高达88 4%。本实验得到的抗坏血酸过氧化物酶基因的cDNA序列已登录到GenBank数据库中,登录序号为:AY282755。

毛白杨抗坏血酸过氧化物酶基因PtAPX2的克隆表达及分析

以毛白杨总RNA为模板反转录得到cDNA,克隆获得抗坏血酸过氧化物酶基因家族中的一个成员PtAPX2 864bp的编码序列。该基因编码的蛋白包含287个氨基酸,理论分子质量为31.78ku,C末端包含锚定于过氧化物酶体跨膜结构域,推断其为过氧化物酶体定位蛋白。构建了PtAPX2原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了纯化的重组蛋白,并对其进行了酶学性质分析。PtAPX2对抗坏血酸的Km值为(1.37±0.22)mmol/L,Vmax值为(3.95±0.46)mmol/(L·min·mg);对H2O2的Km值为(0.026±0.003)mmol/L,Vmax值为(1.27±0.03)mmol/(L·min·mg);该酶在28℃,pH7.0～7.4时活性最高。实时荧光定量PCR分析表明,PtAPX2在杨树老叶叶肉中表达量最高。对PtAPX2亚细胞定位、底物结合特征、酶学性质及组织特异性表达的分析加深了对木本植物抗氧化机理的认识。

枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX生物信息学分析及植物表达载体的构建

利用生物信息学软件对已获得的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA序列ZjAPX进行了同源性及功能位点等多项参数分析。结果表明,此序列为全长753 bp的开放读码框(ORF),编码251氨基酸,分子量为62.55 kDa,理论等电点为5.10,为一个膜外蛋白;序列保守性分析表明,该序列具有典型的铁氧化还原蛋白结合区域,属于一个典型的植物亚铁血红素过氧化物酶家族蛋白;氨基酸序列相似性分析表明,该蛋白与已知的其他植物抗坏血酸过氧化物酶APX具有极高的同源性,与可可树APX和陆地棉APX同源性均为93%,命名为ZjAPX(DDBJ/EMBL/GenBank注册号:AB608053)。用Swiss Model程序(http://au.expasy.org/tools/)推测了ZjAPX基因编码蛋白的三维结构。以ZjAPX的cDNA序列为模板,PCR扩增后,经限制性内切酶消化,与PEZR(K)-LNY载体进行重组连接,测序结果显示,其植物表达载体构建成功。此结果为研究枣树抗坏血酸过氧化物酶基因在植物体内的生物学功能以及可能的活性调节方式奠定了基础。

中国绿水螅抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、抗体制备及表达分析

为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame,ORF) 1104 bp,共编码367个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.79 kD。BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界;通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的APX序列各自形成单系群。把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中,重组质粒转化E.coliBL21 (DE3)菌株,IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX,再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay,WB)。在不同光照时长梯度(光强度2000 lx,每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d,实时定量PCR (Quantitative real-timePCR,qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调。在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内,此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧。

香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是植物重要的过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)清除酶之一。通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为MaAPX2基因。MaAPX2基因是香蕉APX基因编码框全长cDNA,包含一个750 bp的最大开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码249个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列结构域比对发现,在MaAPX2N端具有典型的APX活性位点(APLMLPLAWHSA)和过氧化物酶近端血红素配体序列(DIVALSGGHTL)的保守结构域,属于典型的APX蛋白。系统进化树比对分析表明,MaAPX2与马蹄莲ZaAPX(AAC08576.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaAPX2基因组成型表达于香蕉各个组织,在叶片中表达量最大。在耐病和感病品种中,MaAPX2基因均上调表达,但在耐病品种中MaAPX2基因在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。MaAPX2基因可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。

高粱抗蚜反应中抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的表达模式分析

活性氧(ROS)是植物有氧代谢的副产物,本身具有毒性。H2O2作为ROS家族中的一员,在植物抵御病虫害侵染过程中扮演着重要角色。为了探明活性氧途径相关基因在高粱对高粱蚜的防御反应中所发挥的作用,以高粱抗蚜品种HN 16(包含RMES1基因)和感蚜突变体(RMES1突变)作为研究材料,对蚜虫取食过程中(0,24,48,72h和96h)抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002G431100)的表达模式进行了分析。结果表明,在蚜虫取食的最初24h内,该基因在HN 16和感蚜突变体间没有明显差异,但当蚜虫取食48h后,HN 16中的表达量显著高于突变体,蚜虫取食72h后突变体中的表达量显著下降,但在HN 16中则始终维持在相对稳定的水平,说明该基因在RMES1介导的抗虫反应中发挥着积极的作用。

植物抗坏血酸过氧化物酶基因家族研究进展

抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.11)是植物体内尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶.就抗坏血酸过氧化物酶的酶学特性、基因家族成员组成与细胞内分布、基因诱导表达特性与其在基因工程中的应用做了介绍,并讨论了其进一步的研究方向.

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.

黄瓜抗坏血酸过氧化物酶基因的鉴定和特征分析

植物抗坏血酸过氧化物酶基因在逆境应答和发育过程中具有重要功能,但是在我国重要蔬菜黄瓜中缺乏报道。本文通过生物信息学的方法,从黄瓜基因组中鉴定出6个抗血酸过氧化物酶基因,并对它们的染色体分布、基因结构、系统进化和顺式元件进行了系统分析。结果显示,黄瓜APX分布在不同的染色体上,编码区大小在750~1425 bp,含有8个以上外显子,预测编码蛋白定位在细胞质或者叶绿体中。它们都具有抗坏血酸过氧化物酶的特征结构域和磷酸化及豆蔻酰化位点。在它们的上游基因序列中,存在多个逆境和激素应答顺式调控元件,暗示它们在逆境应答中具有一定功能。

采后荔枝果皮抗坏血酸过氧化物酶基因的差异表达试验初报

根据荔枝果皮APX基因cDNA全长,设计RT-PCR引物,以actin基因为内标,对采后不同储存时间荔枝果皮APX基因mRNA表达情况进行分析。结果表明:采后保湿储存处理的荔枝果皮APX基因mRNA相对丰度在采后24h迅速升高,而后升高幅度减缓。

毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆技术得到1个毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为PcAPX。该基因编码249个氨基酸残基,预测分子量为33.01kD。采用原核表达技术在大肠杆菌中表达并纯化该蛋白并进行酶活性分析,结果表明:重组PcAPX蛋白对抗坏血酸(AsA)和过氧化氢(H2O2)有很高的活性,其对抗坏血酸的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为(0.71±0.03)mmol·L-1和(0.41±0.02)mmol·L-1·min-1·mg-1;对过氧化氢的Km和Vmax分别为(0.60±0.21)mmol·L-1和(0.35±0.12)mmol·L-1·min-1·mg-1,表明PcAPX对AsA和H2O2拥有较高的催化底物的能力和催化效率。利用实时定量RT-PCR分析毛白杨PcAPX基因的表达模式,结果表明其在老叶中表达量高于新叶、韧皮部、形成层和根部。该研究结果将进一步促进毛白杨APX基因家族成员参与植物生长调控的研究。

杂交小麦抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其在种子老化中的潜在功能分析

以BS型二系杂交小麦BS1453/11GF5135及其BS1453(母本)、11GF5135(父本)的种子为材料,在BS1453/11GF5135中通过同源克隆获得抗坏血酸过氧化物酶基因TaAPX。该基因包含一个832 bp的ORF,共编码277个氨基酸。通过进一步生信分析预测miRNA与TaAPX基因的互作关系,发现TaAPX基因可能受miR396等抗逆及种子活力相关miRNAs的调控。另外通过蛋白互作预测分析,发现APX蛋白主要与氧化还原相关的酶互作反应。通过对不同老化时间的父母本及杂交种的胚进行qPCR及酶活性分析,发现TaAPX基因在杂交种及亲本中的表达趋势是先被诱导上调表达,后下调表达,但杂交种子内TaAPX基因的表达量在第7天才开始下降,而亲本种子内TaAPX基因的表达量在第5天开始下降,且miR396与TaAPX互为拮抗作用。随着老化时间的延长,亲本种子内APX酶活性表现为下降趋势,杂交种子内APX酶活性在第3天呈短暂下降趋势,随后上升,第9天开始下降,表明在老化条件下杂交种子内APX酶清除体内过氧化物的能力高于亲本,即杂交种抗老化能力高于其父母本,且TaAPX基因对种子活力的调控是一个复杂的多因素参与的调控过程。本研究为进一步研究BS型杂交小麦种子活力的分子调控机理奠定了一定的基础。

苹果叶片抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA的克隆

根据Genbank上已报道的烟草、辣椒、龙眼和杨树4种植物的抗坏血酸过氧化物酶基因的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE法对皇家嘎拉苹果叶片APX基因进行克隆、分析。结果表明,皇家嘎拉苹果叶片APX基因片段长度为694 bp,与GenBank中已登陆的富士苹果果实、皇家嘎拉苹果花芽、草莓及Rosa hybridcultivar等的APX cDNA的同源性分别为97%,97%,84%和84%。

柠条锦鸡儿抗坏血酸过氧化物酶基因(CkAPX)和谷胱甘肽还原酶基因(CkGR) cDNA片段的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)是植物体内抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的重要组成部分,是植物清除活性氧(ROS)的主要酶。根据前期对不同干旱地区柠条锦鸡儿叶片的转录组测序结果,克隆了2个与清除过氧化氢相关的基因:抗坏血酸过氧化物酶基因(CkAPX)和谷胱甘肽还原酶基因(CkGR)片段,长度分别为509bp和519bp。序列分析表明APX蛋白和GR蛋白在不同物种中相对保守,在已克隆APX和GR基因的物种中,柠条APX蛋白与豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的亲缘关系最近,GR蛋白与豆科植物鹰嘴豆(Cicer arietinum)的亲缘关系最近。对安塞、神木和东胜的柠条叶片中的CkAPX和CkGR的表达量和酶活性分析表明,随着降雨量的减少干旱叶片中柠条CkAPX和CkGR的表达量和活性均呈上升趋势,说明此2基因在增强柠条锦鸡儿的抗旱性方面起重要作用。