超声提取-抗坏血酸还原-催化光度法测定土壤中的碘

建立超声提取-抗坏血酸还原-催化光度法测定土壤中碘含量的方法。将碳酸钠和氧化锌研磨后过孔径为0.25 mm筛,按质量比为3∶2混合均匀,制成艾斯卡试剂。将土壤样品与艾斯卡试剂半熔后用超声提取试样中的碘,分取上清液依次加入抗坏血酸和乙酸,使氧化态的碘和碘单质全部变为碘离子,最后加入4,4'-四甲基二氨基苯甲烷、氯胺T,用分光光度计测定。该方法碘元素的质量浓度在0.0025~0.08 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性关系,相关系数为0.9995,检出限为0.25 mg/kg。采用所建方法对土壤样品进行6次平行测定,测定结果的相对标准偏差为3.50%~9.40%;对国家标准物质GBW 07409、GBW 07408a、GBW 07407a 3种标准物质进行测定,测定值均在标准值范围内,相对误差分别为3.41%、0.63%、1.05%。该方法适合于大批量土壤样品中碘的测定。

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸。通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性。结果表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径。

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

棉花单脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆及原核表达

以棉花纤维组织为材料,根据NCBI棉花EST数据库中MDAR基因序列的已知信息,利用5′-RACE获得GhMDAR基因全长。结果显示,该基因开放读码框为1 305bp,编码包含435个氨基酸的蛋白质,分子质量约为52ku。构建原核表达载体pET28a-GhMDAR并转化大肠杆菌,经过测序和酶切鉴定后,成功构建重组体pET28a-GhMDAR;将重组体导入大肠杆菌BL21诱导表达,经过SDS-PAGE分析,显示成功获得分子质量为52ku左右的诱导表达蛋白GhMDAR。

棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化

为进一步探讨脱氢抗坏血酸还原酶的生物学功能,克隆棉花的脱氢抗坏血酸还原酶基因,对该基因进行了原核表达,并对重组蛋白进行纯化和分析。通过RT-PCR方法扩增脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,利用BamH I和Xhol I酶切位点将其克隆至组氨酸(histidine,His)融合蛋白表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(isopropy--βD-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物,并用亲和层析柱纯化重组表达的pET28a-DHAR蛋白。结果表明:重组体PET28a-DHAR经测序和酶切鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析目的蛋白高效表达,相对分子量为26 kD左右,并获得了纯化的His-DHAR融合蛋白。

改良抗坏血酸还原法测定血清磷脂含量

对传统血清磷脂测定的抗坏血酸还原法进行了改良 ,大大减少了强酸的用量 ,其浓硫酸、过氯酸的用量只有改良前的 30 % ,消化时间缩短为改良前的 5 0 %～ 6 2 % ,血清用量减少为改良前的 40 %。改良后 ,血清磷脂测定结果的变异系数为 3.4%～ 3.7% ,回收率为 94%～ 1 0 9% ,平均回收率为 1 0 0 .8%。对 5 0份正常成人血清标本的磷脂测定结果表明 ,改良前后无显著性差异 (2 .81 3± 0 .333mm ol/ L 比 2 .882± 0 .31 6 mmol/ L,P>0 .0 5 ) ,其相关系数为 r=0 .991。上述结果表明 ,用改良抗坏血酸还原法测定血清磷脂含量 ,可大大减少强酸用量、缩短消化时间、减少血清用量 。

植物脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)研究进展

脱氢抗坏血酸还原酶是AsA-GSH循环中能够促进抗坏血酸再生的关键酶。文章从植物脱氢抗坏血酸还原酶的发现、功能及分子生物学等方面的研究进展作一综述,以期为该酶的深入研究及其合理利用提供参考。

辣椒单脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆与序列分析

以番茄单脱氢抗坏血酸还原酶基因序列为信息探针,在GenBankdbEST数据库中找到高度同源的辣椒EST序列,通过人工序列拼接及RTPCR得到了辣椒该基因的cDNA序列,命名为CaMDHAR。CaMDHAR与番茄单脱氢抗坏血酸还原酶cDNA序列一致率为92%,包含一个长为1302bp的完整的开放读码框,推导的氨基酸序列与番茄、黄瓜、花椰菜、豌豆的胞质单脱氢抗坏血酸还原酶基因的一致率分别为92%、77%、76%、76%。

苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因cDNA片段的克隆及序列分析

以皇家嘎拉苹果叶片为材料提取总RNA,合成cDNA第一链后,先利用巢式PCR获得苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因中间片段,再利用3-′RACE方法进一步获得3′末端核酸序列,共得到840 bp包含完整3′末端的DHAR基因cDNA片段,其序列与烟草、水稻、番茄中DHAR基因序列的同源性均大于70%,证明所克隆到的核苷酸片段确为苹果DHAR基因cDNA片段。

哈密瓜脱氢抗坏血酸还原酶基因的鉴定及冷胁迫表达分析

为阐明哈密瓜脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)基因的基本性质及在响应冷胁迫过程中的表达水平,基于生物信息学对2个哈密瓜DHAR基因(CmDHAR)的基本信息、多序列比对、系统进化关系、共线性关系、基因结构域特征、蛋白质三级结构、蛋白质-蛋白质相互作用及冷胁迫下的抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)含量、DHAR活力、DHAR基因的表达水平及其基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)进行研究。结果表明,2个CmDHAR编码蛋白氨基酸的长度分别为297 aa与206 aa,等电点分别为8.67与5.99,分子质量为33 082.9 Da与22 891.6 Da。多序列比对结果表明CmDHAR基因具有保守性较高的谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-N端功能结构域。基因结构分析结果表明CmDHAR包含6个外显子、6个保守基序、3类顺式作用元件。共线性分析表明哈密瓜与西葫芦、笋瓜和南瓜在物种进化过程中更为接近。蛋白质三级结构预测CmDHAR2主要包含α-螺旋、无规卷曲、延伸链和β-转角等。蛋白互作分析表明CmDHAR家族蛋白与哈密瓜其他GST家族蛋白之间联系紧密。冷胁迫下耐冷型哈密瓜"伽师瓜-310"中的AsA含量、DHAR活力及CmDHAR基因表达量明显高于不耐冷型的"金皇后-308"。GSEA结果表明CmDHAR基因参与结构分子活性、大分子复合物、细胞膜封闭内腔以及抗氧化活性等生物过程。本研究阐明了CmDHAR的生物信息学特点,证明了DHAR基因在哈密瓜抵御冷胁迫过程中的重要性。

铋盐催化剂抗坏血酸还原剂测定磷方法

铋盐催化剂抗坏血酸还原剂测定磷方法相里炳铨（北京市农林科学院植物营养与资源研究所１０００８１）元素磷的测定方法甚多：有重量法、容量法、比色法及仪器分析等等。本试验以铋盐作催化剂对抗坏血酸还原磷钼兰效果及适合哪种含量磷样本的测定作了考察了解。一、反应条...

铋盐催化剂抗坏血酸还原剂测定磷的方法

铋盐催化剂抗坏血酸还原剂测定磷的方法相里炳铨（北京市农林科学院植物营养资源所１０００８１）元素磷的测定方法甚多：有重量法、容量法、比色法及仪器分析等等。其中比色法就有多种，本试验以铋盐作催化剂对抗坏血酸还原磷钼兰的效果、影响及更适合哪种含磷量样本的测...

抗坏血酸还原法测定工作场所空气中的磷酸含量

为了建立工作场所空气中磷酸含量的测定方法,利用磷酸与钼酸铵生成磷钼酸铵,抗坏血酸再将磷钼酸铵还原生成蓝色络合物的性质,对抗坏血酸还原法进行了优化。结果表明:空气样品中加入4.5 mol/L硫酸溶液4.0 mL、40 g/L钼酸铵溶液1.0 mL、17 g/L抗坏血酸溶液1.5 mL,沸水浴显色反应25 min,最后在815 nm波长处进行检测,磷酸检出限为0.016μg/mL,最低检出浓度为0.011μg/mL(以采集75 L空气样品计),测定范围2~200μg,回收率98.0%~101.7%。该方法简单快捷、灵敏度高、试剂用量少,适合工作场所空气中的磷酸含量测定。

抗坏血酸还原—石墨炉原子吸收法测定环境样品中痕量金

复杂的工业固体废渣,采用王水溶解,泡沫塑料吸附富集分离干扰元素,硫脲解脱,由于应用抗坏血酸还原,使石墨炉原子吸收法测定环境样品中的痕量金的方法,灵敏度更大提高,检出限可达到0.3 ng/g,准确度、精密度均能满足规范要求。而且方法简便快捷。

铋盐—抗坏血酸还原磷钼蓝光度法快速测定钢中磷

研究了以硝酸铋作催化剂，抗坏血酸还原磷钼蓝光度法快速测定钢中磷。λmax=690nm，摩尔吸光系数ε=1.75×10^5l·mol^-1·cm^-1,0-70μg/50ml服从比耳定律。

普通小麦中双脱氢抗坏血酸还原酶(TaDHAR)基因的克隆与生化特性分析

利用同源克隆技术从六倍体普通小麦中获得了两个不同的双脱氢抗坏血酸还原酶(TaDHAR)基因的cDNA克隆。器官表达模式分析表明,这两个TaDHAR基因(暂时命名为TaDHAR1和TaDHAR2)在小麦根、茎、叶、幼穗以及开花后10d、20d和30d的种子中均有表达,为组成型表达基因。原生质体表达实验表明,两个基因的产物均可能定位在细胞质中。在细菌中表达并提纯了两个基因的重组蛋白。体外生化测定表明两个重组蛋白均具有将双脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸的能力,其最适pH为7.5,在37oC时的活性比25oC高,但25oC条件下pH6.0和7.0时,两个DHAR蛋白的活性显著不同。本研究的结果为进一步揭示TaDHAR基因在小麦抗坏血酸代谢中的生理作用奠定了基础。

抗坏血酸还原-钼蓝分光光度法测定环境空气中五氧化二磷

建立了氯乙烯滤膜采样,抗坏血酸还原-钼蓝分光光度法测定环境空气中五氧化二磷的方法,确定了测定最佳波长和比色皿规格,比较了反应体系不同的酸度,钼酸铵、抗坏血酸及酒石酸锑钾的试剂用量,显色温度和时间等对方法的影响,同时分别对氯乙烯滤膜、玻璃纤维滤膜和石英滤膜进行了对比,发现氯乙烯滤膜具有较低的本底空白;经条件优化后,标准曲线相关系数为0.9999,当采样体积为5 m3时,方法的检出限和测定下限分别为0.15μg/m3和0.60μg/m3,高低两种浓度的空白滤膜和实际样品加标,方法的精密度均在10%以内,加标回收率在97%～110%之间。分别研究了As,Hg,Cr,Si和氟化物等对方法的干扰和消除,当As含量大于0.2μg/m3,Cr（Ⅵ）含量大于200μg/m3时对方法负干扰,Na SO3溶液和Na2S2O3溶液的混合还原剂可以消除,使用混合还原剂先配制再加入的方法可以在一定程度上消除含硅化合物的正干扰,Hg和氟化物对方法不产生干扰。

星星草脱氢抗坏血酸还原酶(PtDHAR)cDNA的克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸代谢循环中的关键酶,在多种植物中与抗胁迫相关。为了获得抗盐碱植物星星草中该基因序列,利用RACE技术,从星星草中克隆出脱氢抗坏血酸还原酶基因(PtDHAR)的cDNA全长序列,其GenBank登录号为HM125046。PtDHAR cDNA核苷酸序列长度为987bp,开放阅读框为639bp,编码213个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很高的同源性。Northern杂交分析表明,该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高。

江南卷柏脱氢抗坏血酸还原酶的分子特性

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)在植物抗坏血酸?谷胱甘肽循环中发挥着重要作用。利用同源克隆技术从江南卷柏中克隆到2个脱氢抗坏血酸还原酶基因,分别命名为SmDHAR1和SmDHAR2。SmDHAR1和SmDHAR2分别编码218和241个氨基酸,预测分子量分别是23.97 kDa和27.33 kDa。基因组序列分析显示这2个基因分别含有5和6个内含子。器官表达模式分析发现这2个基因在根、茎、叶中均有表达,是组成型表达基因。在大肠杆菌中表达并纯化了2个基因的重组蛋白。酶活性分析显示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白对底物DHA的活性有显著差异,分别是19.76和0.17μmol/(min.mg)。热力学稳定性分析显示这2个重组蛋白的热力学稳定性具有明显差异。因此,基因结构与酶学性质的差异预示着这2个基因可能存在功能上的分化。

麻疯树脱氢抗坏血酸还原酶基因克隆及重组蛋白纯化

利用RACE技术克隆出麻疯树脱氢抗坏血酸基因JcDHAR,构建原核表达载体pET-28a-JcDHAR,并对重组菌表达的条件进行了优化,进而进行Ni亲和层析纯化蛋白.结果表明:表达产物与预期大小相符,His-JcDHAR蛋白质的分子质量为30kD;在37℃的条件下0.1mM的IPTG诱导表达5h时,获得了可溶性重组蛋白,通过体外酶学反应鉴定,纯化样品具有酶学活性,表明JcDHAR原核表达成功.