天然抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞及鳞癌细胞的增殖及Bcl-2,c-Myc表达的影响

目的 探索天然抗角蛋白自身抗体 (AK auto Ab)对培养角质形成细胞及鳞癌细胞凋亡相关蛋白的表达影响 .方法 经体外培养人角质形成细胞及鳞癌细胞 ,以不同滴度的天然抗角蛋白自身抗体作用 ,并用 MTT法及免疫组化检测 .结果 AK auto Ab对二者的增殖有着明显的抑制作用 ,且呈一定的剂量 -效应关系 .可促进二者凋亡相关蛋白 c- Myc的表达 ;对 Bcl- 2在 SCC中的表达表现为抑制作用 ,而对其在KC中的表达作用却不明显 .结论 天然抗角蛋白自身抗体对培养角质形成细胞及鳞癌细胞的增殖起着抑制作用 。

天然抗角蛋白自身抗体产生细胞的检测

目的明确产生天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratin autoantibody,AK auto Ab)的B细胞的类群和定位。方法取SPF级C57BL/6小鼠的腹腔细胞及脾细胞,进行体外培养,采用ELISA方法分析培养细胞分泌AK auto Ab的水平,ELISPOT方法分析分泌AK auto Ab的细胞数。结果腹腔细胞中分泌AK auto Ab的细胞数远多于脾细胞,其分泌的抗体滴度也显著高于脾细胞。结论AK auto Ab主要来源于腹腔B细胞,B1细胞可能是产生AK auto Ab的主要细胞。

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达

目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb)3B4的单链抗体(scFv),并测定其活性。方法:分别以pMD18TmAb3B4VH和pMD18TmAb3B4VL为模板进行PCR,扩增mAb3B4的VH和VL基因,然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中。经DNA序列测定正确后,转化大肠杆菌,用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv;用ELISA检测其与亲本mAb3B4的抗原结合活性的改变。结果:对扩增的mAb3B4的VH和VL基因进行测序,结果表明VH基因与原序列完全一致,VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变。用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达,其与亲本一样具有多反应性,但抗原结合模式不完全相同。结论:成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体,表达的scFv与mAb3B4的抗原结合活性有一定的差异,为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础。

高滴度天然抗角蛋白自身抗体转基因小鼠的肾脏损害分析

目的分析高表达天然抗角蛋白自身抗体的情况下,转基因小鼠肾脏的自身免疫状态。方法选择常规条件下饲养的抗角蛋白自身抗体转基因小鼠为研究对象,Bradford法检测尿蛋白并进行聚乙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳;对肾脏组织进行苏木素-伊红(HE)、过碘酸-雪夫(PAS)染色,并行免疫荧光、电镜等分析。结果与同窝对照小鼠相比,抗角蛋白自身抗体转基因小鼠尿蛋白明显升高(P<0.05),以混合性蛋白尿为主:电镜以系膜增殖性肾小球肾炎为主,荧光显微镜下在系膜区可见IgM类物质呈颗粒状沉积(++～+++)。结论抗角蛋白自身抗体转基因小鼠有发生自身免疫性疾病的倾向,自身抗体在肾脏的沉积可能是疾病发生的原因。

天然抗角蛋白自身抗体识别的角蛋白模拟表位的研究

目的探索利用天然抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)淘筛噬菌体递呈的随机肽库,获得在体内具有功能活性的角蛋白模拟表位方法。方法用角蛋白亲和层析柱从正常人混合血清中分离并纯化AKautoAb,然后进行生物素标记;用生物素化的AKautoAb对噬菌体递呈的随机15肽库进行3轮淘洗并进行ELISA检测;挑取23个阳性克隆进行DNA测序,分析所获数据并进行竞争实验。结果DNA测序分析表明,AKautoAb特异识别3个抗原表位区:SLSPMPTTNRR、PPLIPIPLRTM和TTPRPPMRIMLPRIT,其中SLSPMPTTNRR可能含有优势表位;携有这些短肽的噬菌体可与AKautoAb特异结合,角蛋白可阻断这种特异的结合反应。结论利用噬菌体随机肽库技术成功地获得了AKautoAb所识别的角蛋白模拟表位。