尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因的功能,构建了该基因敲除突变体并对其表型特征进行了分析。结果表明,与野生型菌株相比,fpd1基因敲除突变体生长减慢,产孢量显著降低,对巴西蕉的致病性明显减弱;fpd1基因可能在尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究fpd1基因的功能和尖孢镰刀菌的致病机理奠定了基础。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。

尖孢镰刀菌古巴专化型fgb1基因敲除突变体的构建与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白β亚基编码基因fgb1的功能,构建fgb1基因敲除突变体,分析fgb1敲除突变体的表型。结果表明:敲除fgb1基因导致突变体菌落在PDA培养基上生长减慢,产孢量和菌丝分枝减少;致病性测定结果表明fgb1基因敲除突变体对巴西蕉的致病性减弱;用激光共聚焦显微镜观察感病香蕉根系,发现fgb1基因敲除突变体仍可在根系维管束中定殖。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型中的作用奠定了基础。

尖孢镰刀菌古巴专化型SIX7基因分析

SIX蛋白编码基因最早由尖孢镰刀菌番茄专化型入侵的番茄木质部蛋白质组中发现,且成功用于区分尖孢镰刀菌番茄专化型的3个生理小种。一些SIX编码基因亦在引起香蕉枯萎病的Fusarium.oxysporum f.sp.cubense(简称Foc)中有报道,为区分Foc不同生理小种或亚型,比较分析了Foc中的SIX7基因序列及其特异性。以现有的SIX7基因序列设计合成引物,通过PCR扩增并测序,比较分析国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX7基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属病原菌共39株菌株分析了SIX7基因序列的特异性。研究发现所设计合成的SIX7基因引物序列仅能从供试的亚热带4号生理小种(ST4)中扩增出663 bp的目的条带。亚热带4号生理小种(ST4)中仅有的SIX7基因序列结合Foc4特异性引物Foc-1/Foc-2可快速区分Foc4亚型,提供了快速区分香蕉枯萎病病样内的Foc4亚型的分子鉴定手段,可指导蕉农及时采取有效防控香蕉枯萎病的措施。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1(FoSTIP1)基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4,Foc4)转录因子FoS kn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1, STI1)结构域和多个三角形4肽重复序列结构域(tetratricopeptiderepeat,TPR)。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoS TIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H_2O_2诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H_2O_2诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoS kn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。

链霉菌702抗尖孢镰刀菌次级代谢产物的分离鉴定及活性研究

从链霉菌702代谢产物中分离纯化抗尖孢镰刀菌的活性成分。以抗尖孢镰刀菌活性为导向,采用多种色谱分离技术对活性成分进行分离纯化,并对其理化性质和波谱学数据进行测定和综合解析,鉴定其化学结构。结果从链霉菌702代谢产物中分离得到1个多烯大环内酯化合物,经鉴定为制霉色基素(Fungichromin),该化合物具有显著的抗尖孢镰刀菌作用,其尖孢镰刀菌古巴"专化型"FOC1、FOC4的EC50和EC90分别为4.7、3.4μg/mL和21.5、53.1μg/mL。

外源酚酸对生防细菌拮抗尖孢镰刀菌西瓜专化型的影响

为明确外源酚酸影响下生防细菌对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的拮抗作用,在添加不同质量浓度邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的条件下,通过室内培养试验,定期测量FON和生防细菌菌落的直径,结合对峙培养试验,计算不同外源酚酸影响下生防细菌对FON的抑菌率。结果表明:质量浓度为10~50 mg/L的邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸对FON的生长均具有促进作用,对生防细菌的生物活性具有抑制作用;外源添加30 mg/L以上酚酸,可显著降低生防细菌的抑菌率,最高降幅达28.19%;生防细菌菌悬液浓度越低,酚酸对抑菌率的降低作用越强;混合酚酸对生防细菌的抑制作用较相同质量浓度的单一酚酸更强。在酚酸积累的环境中施用生防细菌应适当提高生防细菌浓度,以使生防细菌对病原菌的拮抗性保持在较高水平。

尖孢镰刀菌古巴专化型FocGSNOR基因功能初步分析

在尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种基因组中鉴定到一个编码S-亚硝基谷胱甘肽还原酶的基因FocGSNOR。为了探索FocGSNOR在尖孢镰刀菌生长和对寄主致病力中的作用,本研究首先构建了该蛋白编码基因的敲除突变体菌株,并进一步对其生长和致病等表型进行了分析。结果发现,FocGSNOR基因的敲除明显抑制了尖孢镰刀菌的营养生长、产孢及其对寄主香蕉植株的致病力。另外,与野生型菌株WT相比,敲除突变株ΔFocGSNOR对抑菌药物异菌脲、三唑酮和过氧化氢的抗性有明显差异。以上结果表明FocGSNOR是尖孢镰刀菌重要的致病因子。

农抗702及其单体组分对尖孢镰刀菌的抗菌毒力测定

探索农抗702及其两个单体组分对香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种(FOC1、FOC4)的抗菌活性的毒力测定。分别以农抗702、其中两个单体组分Dzp8和Dzp9以及那他霉素为供试材料,以FOC1,FOC4为靶标菌。抗菌活性的测定方法采用菌丝生长速率法。那他霉素对FOC1,FOC4的EC50和EC90分别为2.08,1.71,6.6,11.96μg/mL;样品Dzp9对FOC1,FOC4的EC50和EC90分别为4.67,3.41,21.54,53.09μg/mL;农抗702对FOC1,FOC4的EC50和EC90分别为20.98,16.84,50.68,62.18μg/mL。那他霉素、Dzp9样品和农抗702这3种抗生素对供试的靶标菌有较好的抑菌作用,而供试靶标菌对Dzp8样品不敏感。

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明:转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种FoSP1基因功能的初步分析

香蕉枯萎病是我国香蕉生产中危害最大,且难以防治的一种真菌病害。由于香蕉枯萎病的影响,我国近年来香蕉种植面积逐年减少,给我国亚热带、热带香蕉产业带来了巨大的经济损失。该病害是由于香蕉的维管束受到病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)入侵而发生,其繁殖速度快,引起香蕉叶片黄化和植株萎蔫。通过比较Foc1号生理小种(Foc1)N2菌株和4号生理小种(Foc4)B2菌株的基因组及转录组序列,筛选出位于基因组特异区间并且表达量较高的分泌蛋白FoSP1。结果表明:FoSP1基因开放阅读框为387 bp,编码129个氨基酸,其信号肽切割位点位于第20~21位氨基酸残基之间,且该蛋白无任何已知的结构域和功能位点,因此推断出FoSP1是一个新的分泌蛋白。为了研究该蛋白在Foc4菌株中的生物学作用,本研究利用split-marker的方法敲除了B2菌株的FoSP1基因,并对获得的正确敲除突变体进行表型分析和致病性测定。结果表明:相比野生型B2菌株,FoSP1基因敲除突变体菌丝的营养生长无显著差异,对NaCl、山梨醇和H_(2)O_(2)等外源胁迫均表现不敏感,但敲除突变体的产孢量和分生孢子萌发率显著降低,且对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测分泌蛋白FoSP1不参与Foc4菌株B2的营养生长,但在其产孢及致病的过程中发挥着重要作用。此结果为进一步研究Foc4基因组特异区间分泌蛋白的致病机制奠定基础。

尖孢镰刀菌古巴专化型胱硫醚γ-合成酶的功能分析

甲硫氨酸在真菌、细菌和植物的生物学过程中起着重要作用。禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的FgMETB基因编码一个胱硫醚γ-合成酶,是甲硫氨酸合成所必需的。本研究利用同源重组的方法,在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4(Foc4)获得了FgMETB同源基因FoMETB的敲除突变体菌株;与野生型菌株相比,突变体菌株ΔFoMETB在以SO_(4)^(2-)为唯一硫源的基本培养基(minimal medium)上不能生长。1 mmol/L甲硫氨酸的添加恢复了突变体菌株ΔFoMETB的生长,但半胱氨酸的添加不能恢复该缺失突变体的生长,说明FoMETB的敲除阻遏了Foc4半胱氨酸转化甲硫氨酸的通路。此外,ΔFoMETB的气生菌丝和菌丝干重明显减少、分枝增多、产孢量显著降低、疏水性缺失和对巴西蕉组培苗的致病性显著减弱。由此表明,FoMETB参与调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生理特性和致病性,甲硫氨酸合成途径的关键合酶FoMETB有望成为新的抗真菌药物靶标。

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

豇豆枯萎病生防细菌的筛选鉴定及抗病机理初探

豇豆枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的土传真菌病害,是豇豆最主要的病害之一。利用微生物防治是防控枯萎病的重要手段之一。本研究通过对豇豆-水稻轮作土壤中生防菌的分离、筛选和鉴定,研究其拮抗机制与促生功能,并评估其防治和促生效果,为豇豆枯萎病优良生防菌剂的研制和开发奠定基础。采用平板稀释法分离得到93株细菌,再通过平板对峙法筛选出11株对豇豆枯萎病病原菌具有抑制作用的拮抗菌株,其中拮抗菌株SD13抑制率最好(抑制率达到82.0%);结合形态学与16S rDNA序列将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);通过液体共培养方法发现生防菌SD13对豇豆枯萎病病原菌的菌丝、孢子均有很强的溶菌作用;采用检测性培养基检测拮抗菌株SD13抑菌胞外酶(纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶)和促生能力相关功能(产嗜铁素、固氮、解无机磷、解有机磷、解钾、产IAA),明确生防菌SD13可以分泌纤维素酶、蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶3种抑菌胞外酶,且具有产嗜铁素、固氮、解无机磷3种与促生能力相关的功能;采用平板对峙法测定生防菌SD13对青瓜枯萎病、辣椒枯萎病等6种病原菌的抑制率,结果表明,生防菌SD13具有广谱抑菌活性,且抑制率达66.7%~82.3%;盆栽实验结果表明,在生防菌SD13的4个不同浓度(10^(4)、10^(6)、10^(8)、10^(9)CFU/mL)处理中,10^(6) CFU/mL的防治效果最好达62.0%,而促生效果仅次于10^(8) CFU/mL。研究结果表明,生防菌SD13具有较强的生防与促生效果,并初步明确了其拮抗机制以及与促生能力相关的功能,在防控枯萎病上具有潜在的应用价值。

尖孢镰刀菌古巴专化型MAPK FoSlt2敲除突变体的转录组分析

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense(FOC)是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology(GO)功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。

香蕉枯萎病菌候选效应蛋白FoSSP20的鉴定和功能初探

为了鉴定课题组前期在Foc4基因组中筛选的候选效应蛋白的毒力功能,以从中选取的FoSSP20为研究对象,通过生物信息学分析其结构,并通过信号肽分泌实验、亚细胞定位实验、烟草瞬时表达实验和qRT-PCR初步分析其功能,结果显示,利用酵母分泌实验验证FoSSP20的信号肽的分泌功能,亚细胞定位分析表明分泌蛋白定位于烟草(Nicotiana benthamiana)细胞的细胞膜和细胞核中。qRT-PCR结果分析表明FoSSP20在香蕉枯萎病菌侵染前期显著上调表达。以上结果表明,FoSSP20是一个经典分泌蛋白,可能在病原菌侵染过程中发挥作用。

尖孢镰刀菌古巴专化型FocGDSL1基因功能分析

在尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种基因组中鉴定到一个编码GDSL家族脂肪酶的基因FocGDSL1。序列分析发现该蛋白在镰刀菌属中及其保守。为了研究FocGDSL1的功能和其对尖孢镰刀菌致病力的影响,首先利用同源重组原理构建了该基因的敲除突变体菌株,并进一步对其表型进行了分析。结果发现,FocGDSL1的缺失不影响尖孢镰刀菌的营养生长及其对抑菌药物的抗性;但是FocGDSL1突变株中色素的合成明显减少。与此同时,FocGDSL1突变株对香蕉植株的致病力显著下降。这些结果表明FocGDSL1虽然不是控制尖孢镰刀菌菌丝生长的关键基因,但是FocGDSL1是尖孢镰刀菌重要的致病力因子,可能是尖孢镰刀菌在侵染的前期,分泌FocGDSL1来降解宿主细胞壁和细胞膜,进而使病原菌在宿主体内定殖。

厄瓜多尔:引进抗枯萎病香蕉新品种

厄瓜多尔将采收第二种抗香蕉枯萎病的香蕉品种——以色列的GAL品种。香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型。GAL品种是该国进口的第二种对抗香蕉枯萎病的香蕉品种,第一种是2022年4月引进的新北蕉品种(Formosana 218)。

黄瓜枯萎病拮抗菌的拮抗促生因子检测及生物效应研究

以黄瓜枯萎病病原菌,尖孢镰刀菌黄瓜专化型(FOC,Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)为靶标筛选拮抗菌。通过初筛和复筛,获得2株对尖孢镰刀菌黄瓜专化型拮抗效果稳定、拮抗能力较强的细菌QHZ-Yb1和QHZ-Yb2(以下简称,Yb1和Yb2),采用平板对峙法测定其拮抗作用,抑菌带宽度达3.37 mm和3.42 mm,抑菌圈直径>2.7 cm,抑菌率分别达到61.9%和62.3%;通过形态学结合生理生化及菌株的16S rDNA序列分析,初步确定这两株菌均为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus);潜在拮抗促生因子的测定结果表明:菌株Yb1和Yb2具有多种拮抗促生因子,其脂肽类粗提取物的抑菌率分别达到57.4%和58.0%,生长素IAA的分泌量可达1.56 mg·L^(-1)和3.69 mg·L^(-1),溶P量为0.77 mg·L^(-1)和1.19 mg·L^(-1),两个菌株均可产嗜铁素、分泌酪蛋白酶;种子萌发试验结果表明:Yb1和Yb2菌液均可促进黄瓜种子的萌发;菌株生物效应的盆栽试验结果表明:Yb1、Yb2以及Yb1+Yb2菌悬液的处理不仅对黄瓜枯萎病有明显的生防效果,而且可显著增加黄瓜植株的生物量,增加黄瓜植株根际土中细菌和放线菌的数量,减少真菌和尖孢镰刀菌的数量,尤其以Yb1+Yb2菌悬液的处理效果最显著,对黄瓜枯萎病的发病率降低11.11个百分点,植株生物量增加56.7%。结论:菌株Yb1和Yb2具有生防潜力,两菌株配合运用效果更好。