人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。

治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus,RV）引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）,基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,与病毒的毒力、致病性密切相关。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

接种狂犬疫苗后抗狂犬病毒抗体水平检测结果分析

目的:为全面了解人接种狂犬疫苗后抗狂犬病毒抗体的水平,保护患者的生命安全,为今后的狂犬疫苗预防接种工作提供第一手资料。方法:对全程接种狂犬疫苗的患者,30天后抽取静脉血,按间接免疫荧光染色法检测抗狂犬病毒抗体。结果:2004年接种狂犬疫苗后抗狂犬病毒抗体水平检测合格率97.6%。其中男性96.9%,女性98.3%。2005年抗狂犬病毒抗体水平检测合格率97.2%,其中男性97.0%,女性97.4%。结论:通过0、3、7、14、28天全程接种狂犬疫苗后,97%以上的患者抗狂犬病毒抗体水平合格,还有3%左右的患者抗体水平低于保护阈值,需进一步加强接种。

5119例狂犬病疫苗全程免疫接种者血清抗体水平检测结果分析

目的了解狂犬病疫苗全程免疫后抗体产生情况及其影响因素,为狂犬病疫苗预防接种工作提供依据。方法采用ELISA法对5119例于我院全程接种狂犬病疫苗者进行抗狂犬病病毒抗体检测并分析结果。结果 5119份血清标本中抗体阳性5035份,总阳性率98.36%。其中男性及女性阳性率分别为97.91%、98.75%;P<0.05。0～19岁、20～59岁及>60岁者抗体阳性率分别为99.3%、98、4%、96.3%,两两比较,P均<0.05;即随着年龄增大,接种疫苗后抗体阳性率呈下降趋势。结论性别对狂犬疫苗接种后抗体的产生有影响;随着年龄的增长,注射疫苗后抗体阳性率逐渐下降。对接种后抗体阴性者应再次进行全程免疫。

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的:建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体(HuMabs)NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法:采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabs NM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果:间接ELISA法检测HuMabs NM57的灵敏度为5ng/mL,组内及组间精密度分别为2.6%～6.0%、8.5%～11.3%。结论:建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabs NM57的检测。

290例注射狂犬疫苗前后抗狂犬病毒抗体检测

用吸收差值火箭电泳法对290例注射狂犬疫苗前后进行抗狂犬病毒抗体检测,显示抗狂犬病毒抗体阳性率为84.1%,其中狂犬疫苗第三针免疫后抗狂犬病毒抗体阳性率为6%,第四针为25%,第五针为80%以上。同时对联合使用狂犬疫苗与抗狂犬病毒血清的42例患者进行抗狂犬病毒检测,结果全部阳性。对注射狂犬疫苗后抗狂犬病毒抗体仍阴性的46例,经补种3～5支狂犬疫苗后,重新测定抗狂犬病毒抗体全部转为阳性。此外,对135例狂犬疫苗免前抗狂犬病毒抗体测定,全部显示阴性反应。

抗狂犬病病毒单克隆抗体研究进展

狂犬病作为一种可防不可治的烈性传染病,采取有效的暴露后处置措施至关重要。当人处于狂犬病Ⅲ级暴露下,接种狂犬病免疫球蛋白(rabies immunoglobulin,RIG)是暴露后处置中的重要环节。源于人或动物血浆的RIG存在产能不足、价格偏高等问题,选择有效的抗狂犬病病毒单克隆抗体代替RIG成为一种趋势。作为WHO推荐的、替代RIG的被动免疫制剂,抗狂犬病病毒单克隆抗体具有适应性强、安全性高等优点。鉴于此,本研究拟对已上市的和正在研发的抗狂犬病病毒单克隆抗体进行综述,为该领域的后续研发提供参考和借鉴。

狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白联用免疫效果观察

目的了解暴露人群使用人狂犬病免疫球蛋白的作用效果和不良反应情况,进一步推广人狂犬病免疫球蛋白的应用。方法将狂犬病暴露人群根据其暴露程度分别采用联合使用狂犬病疫苗与人狂犬病免疫球蛋白和仅注射狂犬病疫苗。对这两组人群在首针免疫后3d及全程免疫15d后的体内抗狂犬病病毒IgG抗体水平进行检测,观察其抗体阳性率及不良反应情况。结果联合使用狂犬病疫苗与人狂犬病免疫球蛋白进行狂犬病预防的人群,其首针疫苗注射3d后的抗体阳性率为91.1%,全程接种15d后的抗体阳性率为98.8%,全身不良反应发生率为3.5%,局部反应发生率为1.3%;单纯使用狂犬病疫苗,相应时间的抗体阳性率分别为0和95.2%,全身不良反应发生率为3.1%,局部反应发生率为1.1%。两者抗体阳性率的差别均具有统计学意义,而不良反应的差别无统计学意义(P>0.05)。结论狂犬病疫苗与人狂犬病免疫球蛋白联合使用,可使体内更早出现抗狂犬病病毒抗体,全程接种后抗体阳性率也高于单纯注射狂犬病疫苗的人群。注射人狂犬病免疫球蛋白后无明显不良反应。

42例狂犬疫苗免疫后抗体水平监测

尽管人类对狂犬病的认识已有两千多年的历史,但至今尚无特效的治疗方法,因此,应用狂犬疫苗免疫接种预防仍是有效的措施之一,为探求狂犬病疫苗免疫后的抗体水平,减少疾病的发生,本文报告了42例血清中抗狂犬病毒抗体水平的监测。

抗狂犬病毒单克隆抗体中残留宿主细胞蛋白ELISA定量检测方法的验证

目的验证抗狂犬病毒单克隆抗体(单抗)中残留宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法。方法使用商用中国仓鼠卵巢细胞HCP残留ELISA检测试剂盒,测定2种针对不同表位的抗狂犬病毒单抗原液中的残留HCP,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性、耐用性、检测限及定量限。结果2种抗狂犬病毒单抗发酵液稀释10000倍后检出的HCP含量分别为31.42和19.36 ng/ml。制剂溶液、HEK293F和E.coli培养上清液中未检出HCP。3种浓度的HCP加标供试品的加标回收率均在80%~120%之间。3种浓度的HCP加标供试品重复性检测结果及中间精密度检测结果相对标准偏差均<20%。分别对3次残余HCP检测绘制四参数标准曲线,决定系数均>0.990。在一定范围内改变孵育时间和显色时间,HCP测定结果在合理的偏差范围内。检测限和定量限分别为2和3 ng/ml。结论抗狂犬病毒单抗中HCP残留量的ELISA定量检测方法专属性、准确度、精密度、线性及耐用性良好。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究

为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片。用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性。用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达。结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。

狂犬病疫苗接种者抗狂犬病病毒中和抗体影响因素分析

目的探讨狂犬病疫苗接种后体内抗狂犬病病毒中和抗体产生的影响因素。方法采集2018年1-8月山东、江苏、河南、河北、湖南和安徽6省疑似狂犬病Ⅱ/Ⅲ级暴露后接种狂犬病疫苗的暴露者血清标本,快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测抗狂犬病病毒中和抗体(RVNA)水平,采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。结果全程接种狂犬病疫苗的血清样本为498份,RFFIT检测结果显示,RVNA几何平均滴度(GMT)为4.94 IU/ml,血清阳性率为96.18%(479/498)。不同组别抗体阳性率分析结果显示,免疫时间各组阳性率之间差异有统计学意义(χ^2=7.888,P=0.039),30~90 d组抗体阳性率高于91~180 d组,其他各组比较差异均无统计学意义。多因素分析结果显示年龄、免疫时间是RVNA水平的重要影响因素,其中年龄与RVNA水平呈正相关,免疫时间与RVNA水平呈负相关。免疫时间对RVNA水平的影响最大,影响重要性为0.62。结论接种狂犬病疫苗后能产生可靠的免疫效果,年龄、免疫时间等因素对抗体阳性率及RVNA水平有一定影响。暴露后在及时进行规范完整的暴露后处置外,应对经常暴露于狂犬病的高危人群、免疫力低下者或患有免疫抑制性疾病的人群定期检测血清抗体,对于RVNA滴度小于0.5 IU/ml的接种者应及时进行加强免疫,补接种疫苗,从而有效预防狂犬病。

抗狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验方法的验证

目的对抗狂犬病病毒中和抗体(Rabies virus neutralizing antibody,RVNA)快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)进行验证。方法利用已检测RVNA效价的人狂犬病疫苗免疫后血清建立血清参考品。采用参考血清和狂犬病人免疫球蛋白标准品,评价RFFIT方法的准确性、重复性、稳定性、线性和检测范围。结果共制备5批血清参考品(A、B、C、D和E),RVNA效价分别为57.39、16.54、8.76、1.38和0.08IU/mL。采用效价适中的参考血清C进行RFFIT方法的认证。参考血清样品C加标(4.5IU/mL、2.25U/mL和1.125IU/mL)后的回收率分别为91.70%、80.15%和74.96%。同一实验人员对相同样品检测6次的RVNA中和效价的变异系数(Coefficient of variation,CV)为7.61%;2名实验人员对相同样品各检测3次的RVNA中和效价的CV为3.88%。标准品效价值与RFFIT方法检测值的线性方程为y=0.9524x-0.1192(R^(2)=0.999),最低检出效价为0.04IU/mL。不同病毒-抗体中和时间、细胞-抗体-病毒孵育时间、丙酮固定时间和荧光抗体染色时间测定的参考血清C中和效价的CV均<30%。结论本研究建立的RFFIT方法对人狂犬病疫苗免疫后血清检测具有很好的准确性、重复性、线性和稳定性,推荐在相关血清检测中应用。

一种从抗狂犬病病毒噬菌体抗体库中筛选和验证中和抗体的方法

目的建立一种从噬菌体库抗体库中高效筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。方法①定性分析:从经过灭活的CVS-11筛选噬菌体抗体库中挑取单克隆于96孔板中培养,制备噬菌体抗体,取培养上清进行快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT),选择可明显抑制病毒感染的克隆测序,获得具有中和活性的抗体可变区序列;②定量分析:挑选有中和活性的克隆,重新制备噬菌体抗体颗粒,纯化后进行RFFIT分析;扩增抗体可变区基因,构建真核瞬时表达质粒。瞬转HEK-293 EBNA1细胞,培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。结果定性分析获得的噬菌体抗体颗粒与全分子抗体体外中和活性显著相关;剔除低活性序列后,活性高于0.5 IU/mL的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关;所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性>0.5 IU/mL的序列其全分子抗体体外中和活性均>500 IU/mg。结论构建了一种从抗狂犬病病毒噬菌体库中高效筛选、验证中和抗体的方法。

抗狂犬病病毒单克隆抗体临床试验设计和评价考虑要点

狂犬病是我国重要的公共卫生威胁,抗狂犬病病毒单克隆抗体因批间效价差异小、安全性提高、可大量制备等优势,有替代原有抗狂犬病病毒被动免疫制剂的潜力。本文对抗狂犬病病毒单克隆抗体新药临床试验设计和评价重点关注问题进行了讨论分析。

关于抗狂犬病病毒单克隆抗体临床疗效评价的考虑

狂犬病是我国传染病主要致死病因之一,病死率几乎100%。被动免疫是狂犬病暴露后预防的重要措施之一,目的是在第一针狂犬病疫苗注射后至机体产生足量抗体前的窗口期提供即时的免疫保护。抗狂犬病病毒单克隆抗体(简称狂犬病单抗)定位于狂犬病暴露后被动免疫,相对于现有被动免疫制剂具有成本降低、安全性提高的潜在优势。由于疾病和药物作用特点,狂犬病单抗临床试验设计和疗效评价存在诸多挑战。国家药品监督管理局2022年1月发布了《抗狂犬病病毒单克隆抗体新药临床试验技术指导原则》,为此类产品临床研发提供了具备科学性和可操作性的策略。本文通过分析狂犬病发病特点、被动免疫机制、已有被动免疫制剂的上市临床经验等,总结狂犬病单抗疗效评价中的关键问题,并对指导原则中推荐疗效指标的审评考虑进行说明。

狂犬病疫苗免疫后血清抗体检测结果分析

目的分析狂犬疫苗接种后抗狂犬病毒中和抗体的产生情况。方法暴露者在全程接种狂犬疫苗后10～30d,采集手指尖末梢血0.3 ml,用狂犬抗体酶联免疫吸附间接法作抗体测定。结果1 515例接种狂犬疫苗的暴露者抗体阳性1 458例,阳转率为96.24%,不同年龄人群之间抗体阳性率差异有统计学意义。结论接种狂犬疫苗的暴露者抗体阳转率较高,但未达到100%阳转。