N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的:建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体(HuMabs)NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法:采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabs NM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果:间接ELISA法检测HuMabs NM57的灵敏度为5ng/mL,组内及组间精密度分别为2.6%～6.0%、8.5%～11.3%。结论:建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabs NM57的检测。

抗狂犬病毒单克隆抗体的纯化及标记

对一株稳定、特异、高效的单克隆抗体(mAb)进行了纯化和荧光素(FITC)的标记,利用标记产物与已有的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体标记物相比较,效果良好,二者可以结合(或单独)使用;应用标记好的荧光抗体与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白比较进行血清样品效价测定实验,来确定纯化、标记后的单克隆抗体的灵敏度,结果表明本实验制备的单克隆抗体与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白具有相同的灵敏度,该单克隆抗体测得的血清样品效价结果与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白测得的结果相同。因此,此荧光抗体可应用于狂犬病病毒检测(FAT)、病毒毒力测定(TCID50)、中和抗体实验(FAVN)等方面的检测实验,此荧光抗体可为狂犬病的相关研究提供有力的保障。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面呈现 (phagedisplay)技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞 ,提取细胞总RNA ,通过RT -PCR方法 ,用一组人IgGFab基因特异性引物 ,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因 ,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体 pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒噬菌体抗体库 ,并用纯化的狂犬病毒颗粒和几株抗狂犬病毒鼠单克隆抗体 (单抗 )捕捉狂犬病毒抗原的方法 ,对此抗体库进行富积筛选表达 ,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达。对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析 ,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争 ,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白。其序列资料分析表明 。

小鼠抗狂犬病毒单克隆抗体轻链重链可变区基因的cDNA克隆

狂犬病是一种全球性病毒性疾病,病死率高,目前尚无有效疗法。用单克隆抗体(McAb)治疗病毒病可能有一定疗效,但是大多数McAb来源于小鼠或大鼠细胞,用来治疗人,必然会因种间差异带来变态反应。为克服这种障碍,将McAb技术与重组DNA技术结合,可能为利用McAb治疗病毒病开拓新的前景。

抗狂犬病毒单克隆抗体中残留宿主细胞蛋白ELISA定量检测方法的验证

目的验证抗狂犬病毒单克隆抗体(单抗)中残留宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法。方法使用商用中国仓鼠卵巢细胞HCP残留ELISA检测试剂盒,测定2种针对不同表位的抗狂犬病毒单抗原液中的残留HCP,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性、耐用性、检测限及定量限。结果2种抗狂犬病毒单抗发酵液稀释10000倍后检出的HCP含量分别为31.42和19.36 ng/ml。制剂溶液、HEK293F和E.coli培养上清液中未检出HCP。3种浓度的HCP加标供试品的加标回收率均在80%~120%之间。3种浓度的HCP加标供试品重复性检测结果及中间精密度检测结果相对标准偏差均<20%。分别对3次残余HCP检测绘制四参数标准曲线,决定系数均>0.990。在一定范围内改变孵育时间和显色时间,HCP测定结果在合理的偏差范围内。检测限和定量限分别为2和3 ng/ml。结论抗狂犬病毒单抗中HCP残留量的ELISA定量检测方法专属性、准确度、精密度、线性及耐用性良好。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究

为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片。用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性。用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达。结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。

重组全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体注射液(F61注射液)治疗新型冠状病毒感染合并肾损伤患者的有效性和安全性:一项随机对照的探索性临床研究

目的 探究重组全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体注射液(F61注射液)治疗新型冠状病毒感染(COVID-19)合并肾损伤患者的有效性和安全性。方法 选取2023年1—2月在解放军总医院就诊的COVID-19合并肾损伤患者。将受试者随机分组,对照组采用常规抗新型冠状病毒(抗新冠)治疗,试验组采取常规抗新冠治疗联合F61注射液。给药后随访15 d,监测患者临床症状、实验室检查、心电图及胸部CT,分析F61注射液的有效性和安全性。结果 共纳入12例受试者(试验组7例,对照组5例),两组受试者均未出现临床进展或死亡病例。对照组新型冠状病毒核酸平均转阴时间为3.2 d,试验组为1.57 d (P=0.046);试验组用药后第3天及第5天的COVID-19相关目标症状评分均低于对照组(均P<0.05)。根据临床分型和世界卫生组织(WHO)10分等级疾病进展量表,两组受试者病情均有好转,但差异无统计学意义(P>0.05)。安全性方面,试验组未出现输液相关不良事件,两组受试者表现出不同程度血糖升高、尿葡萄糖升高、尿胆原升高、尿管型阳性及心律失常,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 F61注射液在治疗COVID-19合并肾损伤患者时初步展现出安全性和临床获益,国产药物的临床可及性好,可为临床实践提供更多选择。

伪狂犬病毒单克隆抗体的特性和应用

应用4株伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)作免疫原,建立了23株分泌抗PrV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。根据其免疫生物学特性可分为4个类型:(1)具有FA、ELISA和Western blot特性;(2)具有FA和ELISA特性;(3)具有FA和Western blot特性;(4)只有FA特性。根据ELISA和Western blot试验,McAb可将5株PrV分为两种不同的抗原群。应用此McAb建立并比较了3种检测PrV抗原的方法(FA、RPHA、ELISA)。FA和RPHA特异性强,与分离病毒的符合率分别为88.2％和76.5％。两者的阳性检测率统计学上无显著差异(P>0.05)。RPHA设备简单,操作简便,结果直观,更适于在基层单位推广应用。

抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。

狂犬病毒单克隆抗体的制备和对狂犬病毒中和抗原位点分析

建立了8株分泌狂犬病毒单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。用间接免疫荧光法法(IFA)和细胞酶免疫法(CEIA)测定了这8株McAb腹水的效价,其中4株CEIA效价为10~6.CEIA的敏感性比IFA高1000倍。动物中和试验证实,6株McAb具有中和活性,中和指数高者大于3 000;另2株为非中和抗体。用非酶标记和酶标记中和抗体做相互竞争抑制试验,6株中和McAb可分为3组,分别针对3个不同的抗原位点。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot法分析狂犬病毒中和抗原,显示2条带,分子量分别为61kD和110kD。所用5株酶标中和Mc-Ab均与其有特异性反应,显示两条染色带。

抗IgE单克隆抗体联合变应原特异性免疫治疗的应用进展

抗IgE单克隆抗体目前已被批准用于治疗哮喘和慢性荨麻疹,同时抗IgE单克隆抗体联合变应原特异性免疫治疗(AIT)作为过敏性疾病的辅助治疗已引起普遍关注。研究表明,在AIT治疗中或治疗前添加抗IgE单克隆抗体可显著减少AIT不良反应的发生频率和严重程度,明显改善症状评分,缩短达到维持剂量所需的时间。目前仍需要更大规模的高质量对照试验更好地识别抗IgE单克隆抗体联合AIT的获益人群,以及治疗最佳剂量和持续时间,并评估长期效益、进行成本-效益分析。本文就抗IgE单克隆抗体在AIT中作为辅助治疗的应用进展进行综述。

猪伪狂犬病毒变异株单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异毒株的单抗,以纯化灭活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c雌性小鼠。经间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得2株稳定分泌PRV单抗的杂交瘤细胞:4D8、4F10。2株单抗经亚型鉴定均为Ig G1亚类,轻链为κ链,腹水IFA效价均达1:51 200;IFA与IHC结果显示,二者均能与PRV毒株发生特异性反应;Western blot结果表明,4D8与PRV反应条带大小约为60 k Da,而4F10不与PRV发生反应,推测其可能针对PRV的构象性抗原表位。该单抗的制备对PRV的抗原变异及诊断研究均有重要意义。

分泌抗猪伪狂犬病毒(鄂A株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒（Ｐｒｖ）鄂Ａ株纯化后免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与经８氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）驯化的ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合。经间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）筛选，挑选强阳性孔进行亚克隆，获得５株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体（Ｐｒｖ－ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株，分别命名为４１８、４８３、５７６、６０３、７４４。经体外连续传代及反复冻存、复苏，杂交瘤细胞均能稳体地分泌ＭｃＡｂ。培养上清液及小鼠腹水ＥＬＩＳＡ效价分别为２－５～２－７和１０－５～１０－１０。各株分泌的ＭｃＡｂ不与疱疹病毒科中的ＤＰＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＲＶ及ＰＰＶ发生交叉反应。阻断试验结果显示阻断率均大于５０％。其中６０３、７４４分泌的ＭｃＡｂ对用ＰＲＶ致敏的乳胶具有凝集特性。相加ＥＬＩＳＡ测定证实６０３、４８３、７４４特异性作用同一抗原位点或作用相关极为密切的抗原位点，另４种ＭｃＡｂ作用位点有部分相关性。

抗白细胞介素-5单克隆抗体治疗哮喘效果的Meta分析

目的:系统评价抗白细胞介素-5(IL-5)单克隆抗体治疗哮喘的临床效果。方法:在PubMed、Embase和Cochrane对照试验中央注册中心检索有关抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的随机对照试验文献,检索时间为截至2024年3月,对数据采用CMA 2.0软件进行Meta分析。结果:纳入21篇文献,共8717例患者,试验组4593例,对照组4124例。Meta分析结果显示,在第1秒用力呼气容积(FEV1)、哮喘生活质量问卷评分、不良事件发生情况方面,试验组优于对照组。结论:抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的临床效果较好,可改善患者FEV1、生活质量,且安全性较高。

基于高通量表面等离子体共振技术筛选与TPBG具有高亲和力的单克隆抗体研究

目的探讨从制备的单克隆抗体中快速筛选出与滋养层糖蛋白(TPBG)具有高亲和力的单克隆抗体的方法。方法采用高通量表面等离子体共振技术(SPR),将不同种属的TPBG通过氨基偶联的方式固定在GLC传感器芯片上,梯度稀释的抗体作为流通相,筛选能高度亲和TPBG的单克隆抗体,并测定相互作用的动力学常数。抗体1结合人和食蟹猴TPBG,亲和力分别为65.0、31.6 nmol/L;抗体6结合人、小鼠、食蟹猴TPBG,亲和力分别为77.6、92.1、87.7 nmol/L。结果该研究成功筛选出2种能与TPBG特异性结合的单克隆抗体。动力学图谱显示,这2种抗体与TPBG蛋白的特异性结合稳定。结论采用SPR可筛选出与TPBG蛋白具有高亲和力的单克隆抗体,为开发出一些新型的抗肿瘤药物提供一种方法。

用狂犬病毒单克隆抗体2E9在小鼠引发狂犬病“早期死亡”综合征的实验研究

单克隆抗体9E6和2E9都是针对狂犬病毒糖蛋白(61kD)的两个具有中和活性的单克隆抗体,但它们分别针对两个不同的抗原位点。当它们被动转移给小白鼠后,却产生完全相反的作用。在狂犬病小鼠动物模型上,9E6抗体的被动转移可使小鼠产生对狂犬病毒攻击的保护性免疫。而在相同实验条件下,2E9的被动转移却使小鼠在受狂犬病毒攻击后产生“早期死亡”综合征。而且这种“早期死亡”综台征的发生还依赖于被动转移抗体2E9的浓度,经1:30和1:300稀释的抗体可引起早期死亡综合征,而1:3和1:3000稀释者则不能。结果提示,早期死亡综合征的发生与病毒抗原上的某个决定簇相关,并由针对此决定簇的抗体所介导。

用狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体分析其抗原决定簇

本文通过聚丙烯酰胺凝胶电泳方法精制糖蛋白,用蛋白酶V_8消化的糖蛋白碎片经25%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,转移到硝酸纤维素薄膜上,用糖蛋白单抗进行免疫染色。通过WesternBlot分析技术,得到一个与单抗起阳性反应的多肽碎片(G—V—6),并分析该碎片的氮基酸序列。资料表明,糖蛋白的这个抗原决定簇位于残基130—141位置。结果提示,Western

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。

猪伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出1株稳定分泌PRV gB蛋白抗体的单克隆细胞系,经鉴定该细胞系所分泌抗体为IgG1亚型,腹水纯化抗体的IFA效价为2^-11;细胞培养上清和腹水纯化抗体用于Western blot的最佳稀释比分别为1∶50和1∶5000;杂交瘤细胞诱导小鼠腹水的中和效价为1∶25。IPMA、IFA及Western blot试验结果显示,制备的单克隆抗体能特异性识别PRV gB蛋白。