全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定。方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠。采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA、斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力。结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2。双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型。间接ELISA、斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株。Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合。2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为2.62×10-10mol/L、4.06×10-11mol/L。结论:筛选制备了2株特异性、高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础。

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。

一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的表位及中和活性的研究

目的通过ELISA相加试验和狂犬病毒(Rabies virus,RV)逃逸突变试验对一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(human anti-rabies virus monoclonal antibody,Ab1)进行抗原表位分析。方法将已知表位的对照抗体(CR57和CR4098)和Ab1进行ELISA相加试验;以及对RV逃逸株氨基酸突变位点分析进一步验证Ab1针对的抗原表位,用小鼠中和试验(mouse neutralization test,MNT)分析Ab1的体内抗狂犬病病毒中和活性。结果Ab1和CR57可同时与RV结合;与CR4098存在竞争,Ab1的逃逸株在氨基酸位点333、336发生突变,MNT检测体内中和活性为550.32 IU/mg,MNT和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)结果基本一致。结论该抗体针对III号抗原表位且具有较高的抗狂犬病病毒中和活性。

抗狂犬病病毒单克隆抗体的研究进展

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV）引起的人畜共患的烈性传染病，也是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，人和动物一旦发病，死亡率高达100％，所以至今仍被人们广泛关注。狂犬病是一种典型的自然疫源性疾病，几乎所有的温血动物对RV均敏感，但并非所有动物的易感性均相同，人和家畜仅是偶发宿主。

一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析

目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法 PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293 EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280 nm比值在2.0～2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37 IU/mL,比活达628.21 IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。

抗狂犬病病毒单克隆抗体研究进展

狂犬病作为一种可防不可治的烈性传染病,采取有效的暴露后处置措施至关重要。当人处于狂犬病Ⅲ级暴露下,接种狂犬病免疫球蛋白(rabies immunoglobulin,RIG)是暴露后处置中的重要环节。源于人或动物血浆的RIG存在产能不足、价格偏高等问题,选择有效的抗狂犬病病毒单克隆抗体代替RIG成为一种趋势。作为WHO推荐的、替代RIG的被动免疫制剂,抗狂犬病病毒单克隆抗体具有适应性强、安全性高等优点。鉴于此,本研究拟对已上市的和正在研发的抗狂犬病病毒单克隆抗体进行综述,为该领域的后续研发提供参考和借鉴。

伪狂犬病病毒VP22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接ELISA方法筛选,经3次亚克隆后获得4株PRV VP22蛋白的单克隆抗体1D6、1D9、1B12和2C10。间接ELISA检测4株杂交瘤细胞传至15代均能稳定分泌抗体,且细胞上清液抗体效价均为1∶6400。经亚型鉴定,4株单克隆抗体的重链均是IgG1亚类,轻链皆属于κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体均可与PRV发生特异性反应,并鉴定出2个抗原表位;Western blot和共聚焦试验结果表明,VP22蛋白是病毒早期蛋白,且早期存在于细胞质,晚期移位至细胞核并在核中积累。本研究制备的单克隆抗体将为后续探索PRV VP22蛋白的功能提供材料支撑。

重组全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体注射液(F61注射液)治疗新型冠状病毒感染合并肾损伤患者的有效性和安全性:一项随机对照的探索性临床研究

目的 探究重组全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体注射液(F61注射液)治疗新型冠状病毒感染(COVID-19)合并肾损伤患者的有效性和安全性。方法 选取2023年1—2月在解放军总医院就诊的COVID-19合并肾损伤患者。将受试者随机分组,对照组采用常规抗新型冠状病毒(抗新冠)治疗,试验组采取常规抗新冠治疗联合F61注射液。给药后随访15 d,监测患者临床症状、实验室检查、心电图及胸部CT,分析F61注射液的有效性和安全性。结果 共纳入12例受试者(试验组7例,对照组5例),两组受试者均未出现临床进展或死亡病例。对照组新型冠状病毒核酸平均转阴时间为3.2 d,试验组为1.57 d (P=0.046);试验组用药后第3天及第5天的COVID-19相关目标症状评分均低于对照组(均P<0.05)。根据临床分型和世界卫生组织(WHO)10分等级疾病进展量表,两组受试者病情均有好转,但差异无统计学意义(P>0.05)。安全性方面,试验组未出现输液相关不良事件,两组受试者表现出不同程度血糖升高、尿葡萄糖升高、尿胆原升高、尿管型阳性及心律失常,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 F61注射液在治疗COVID-19合并肾损伤患者时初步展现出安全性和临床获益,国产药物的临床可及性好,可为临床实践提供更多选择。

伪狂犬病毒单克隆抗体的特性和应用

应用4株伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)作免疫原,建立了23株分泌抗PrV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。根据其免疫生物学特性可分为4个类型:(1)具有FA、ELISA和Western blot特性;(2)具有FA和ELISA特性;(3)具有FA和Western blot特性;(4)只有FA特性。根据ELISA和Western blot试验,McAb可将5株PrV分为两种不同的抗原群。应用此McAb建立并比较了3种检测PrV抗原的方法(FA、RPHA、ELISA)。FA和RPHA特异性强,与分离病毒的符合率分别为88.2％和76.5％。两者的阳性检测率统计学上无显著差异(P>0.05)。RPHA设备简单,操作简便,结果直观,更适于在基层单位推广应用。

伪狂犬病病毒gE基因的表达及gE蛋白单克隆抗体的制备

以猪伪狂犬病病毒(PRV)Min-A株pMD-gE质粒为模板,利用所合成的特异性引物进行PCR扩增,获得了1 000 bp的DNA片段,并将其克隆至表达载体pET-30a中,转化到大肠杆菌中进行了原核表达,对表达产物进行了抗原性分析;在此基础上,用纯化的gE蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选和鉴定了分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株。结果显示,原核表达的gE蛋白具有良好的抗原性,其分子质量为46 ku。筛选获得3株分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株,Western-blot和间接免疫荧光试验证实,所获得的3株单抗具有良好的特异免疫反应原性。3株单抗均为IgG1亚类,且轻链均为κ链。

不同剂量重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体注射液人体单次给药的安全性

目的观察不同剂量重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(recombinated human rabies immunoglobin,rhRIG)注射液人体单次给药的安全性。方法采用随机、单盲、安慰剂平行对照的方法,对成功筛选的48名健康受试者按照随机数字表进行分组,共分低、中、高3个rhRIG单次给药组(10、20、40 IU/kg),每组12人,每个剂量组均按3∶1设1个安慰剂(rhRIG的赋形剂)平行对照组,每组4人,依次经上臂三角肌(≤2 ml)、臀大肌(≤10 ml)和大腿外侧肌肉(剩余药液)进行肌肉注射。分别在筛选期(入组用药前14 d内)、用药后7、14和42 d记录不良事件(adverseevent,AE)、严重不良事件(serious adverse events,SAE)、局部反应、全身反应的发生情况,并进行生命体征、实验室(血常规、尿常规、血生化)、心电图、胸片、腹部B超检查。结果不同剂量rhRIG组中共发生7例次AE,分别为谷氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶和谷氨酰转肽酶升高、血白细胞下降、上呼吸道感染、宫外孕,其中宫外孕判断为SAE。上述AE均判断与试验药物无关或可能无关。对照组未发生任何AE/SAE。所有受试者用药后生命体征均未见异常改变。结论受试者单次肌肉注射10～40 IU/kg rhRIG后耐受性良好。

抗狂犬病病毒ERA株单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

将狂犬病病毒ERA株纯化后免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经克隆和间接ELISA筛选,获得3株稳定分泌抗狂犬病病毒ERA株单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为C7、C4和H3。经过鉴定:其腹水效价分别为1∶1×105、1∶5×104及1∶1×104;且与犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)不发生交叉反应;3株单抗均为IgG类型。采用G蛋白亲和层析柱对腹水进行纯化,将纯化后的单抗腹水用FITC(异硫氰酸荧光素)标记制备荧光抗体,建立了检测狂犬病病毒的荧光染色法。结果表明,该方法对狂犬病的实验室诊断具有快速和特异性高的特点。

抗伪狂犬病毒闽A株单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV-FA)免疫Balb/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4G9E9和4H9C9。这2株杂交瘤细胞株细胞培养上清和小鼠腹水效价(ELISA)分别为1∶6400、1∶12800及1∶12800、1∶25600。特异性鉴定结果表明,各株单抗均不与猪瘟病毒、乙脑病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应,这2株抗PRV杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。

抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体的制备及B细胞线性表位鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV HeN1株全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接免疫荧光方法筛选,获得了一株稳定分泌抗PRV g B蛋白的杂交瘤细胞株1E7。Western blot结果显示,MAb 1E7与PRV全病毒和真核表达的g B蛋白均能够反应。阻断ELISA试验显示MAb 1E7与PRV的结合可以被猪阳性血清阻断。抗体亚类鉴定显示MAb 1E7的重链为Ig G2b亚类,轻链为kappa链。利用大肠杆菌原核表达系统,表达一系列截短的g B蛋白,最终确定1E7识别的抗原表位是^(81)SAEESLE^(87)。序列分析和western blot结果表明该表位在各PRV病毒株间相对保守。该MAb的制备为建立具有广泛适用性检测PRV野毒感染和疫苗免疫效果评价的阻断ELISA方法奠定了基础。

抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病病毒抗原检测方法奠定基础。方法将狂犬病病毒Flury LEP株N基因克隆至pGEX-6P-1表达载体中,将纯化后的pGEX-6P-1-RV-N蛋白免疫BALB/c小鼠3次。取小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合后,用pET-32a-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经3次亚克隆筛选后得到1D9、2B6、3C5、6B5及5F2 5株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、2B6、6B5 3株亚类为IgG1,3C5、5F2的亚类为IgM。间接ELISA方法检测2B6单抗细胞腹水效价可达1∶106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5mg/mL的高纯度的单克隆抗体。其免疫荧光试验结果表明5株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。结论制备的单抗具有良好的特异性和敏感性,为后期诊断方法的建立奠定了基础。

抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒 (PRV) g G蛋白作为抗原 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,经细胞融合、克隆后 ,获得了1F6、2 B92株稳定分泌抗伪狂犬病病毒 g G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。 1F6、2 B9培养上清及小鼠腹水效价(EL ISA)分别为 1∶ 2 1 1 、1∶ 2 1 1 及 1∶ 10 0× 2 1 1 、1∶ 10 0× 2 1 2 。 1F6、2 B9的染色体众数分别为 87(80～ 94 )、84 (81～ 87)。经间接 EL ISA鉴定 ,1F6、2 B9单抗分别属于 Ig G2 a、Ig G3亚类。1F6、2 B9与猪伪狂犬病病毒 Ea株感染细胞的间接免疫荧光试验结果表明 ,1F6、2 B9确实为伪狂犬病病毒 g G蛋白的单抗。所得单抗与牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV)

狂犬病毒单克隆抗体的制备和对狂犬病毒中和抗原位点分析

建立了8株分泌狂犬病毒单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。用间接免疫荧光法法(IFA)和细胞酶免疫法(CEIA)测定了这8株McAb腹水的效价,其中4株CEIA效价为10~6.CEIA的敏感性比IFA高1000倍。动物中和试验证实,6株McAb具有中和活性,中和指数高者大于3 000;另2株为非中和抗体。用非酶标记和酶标记中和抗体做相互竞争抑制试验,6株中和McAb可分为3组,分别针对3个不同的抗原位点。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot法分析狂犬病毒中和抗原,显示2条带,分子量分别为61kD和110kD。所用5株酶标中和Mc-Ab均与其有特异性反应,显示两条染色带。

猪伪狂犬病病毒HeN1株gE蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E(gE)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以原核系统表达PRV HeN1株截短的gE(aa127~aa232)蛋白(rgE),并对表达的rgE进行纯化免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,以该病毒感染的Vero E6细胞及真核表达的gE蛋白为检测抗原,采用IFA检测方法筛选杂交瘤细胞系,获得一株稳定分泌抗PRV gE的MAb杂交瘤细胞系(mgE185)。该MAb亚型鉴定为Ig G1型,轻链为Κ链。该MAb不具有中和病毒的活性,其细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1∶80和1∶2 560。Western blot试验显示mgE185可以特异性识别gE蛋白,表明其针对的抗原表位为线性表位。通过截短表达gE蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为^(151)IGDYL^(155),该抗原表位在PRV中高度保守。本研究制备的MAb为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRV gE-ELISA检测方法奠定了基础。

鉴别伪狂犬病病毒强、弱毒株单克隆抗体的制备

用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV-FA)免疫Balb/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA筛选,获得11株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中6株仅与强毒FA反应,而不与弱毒FB、Bartha及gE缺失疫苗株发生反应。特异性鉴定结果表明,各株单抗均不与猪瘟病毒、猪流感病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应。