米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应

[目的]本试验探究药物米非司酮的抗伪狂犬病毒(PRV)作用及其与另一种抗伪狂犬病毒药物氢醌的协同作用,为抗PRV药物的研究和临床应用奠定基础。[方法]用Western blot和qPCR等方法检测米非司酮及其与氢醌联用在体外对伪狂犬病毒复制的影响及其影响的作用阶段,再通过小鼠攻毒保护试验进一步确认其抗病毒作用及与氢醌联用的协同作用。[结果]15μmol·L^(-1)米非司酮具有抗病毒作用,且随着浓度升高而增强,此作用发生于伪狂犬病毒复制早期。体内、体外试验结果表明,米非司酮(体内5μmol·L^(-1)、体外40 mg·kg^(-1))单独或与氢醌(体内5μmol·L^(-1)、体外50 mg·kg^(-1))联用均具有抗病毒作用,与氢醌具有协同抗病毒作用,同时能减轻单独用药对肝脏的损伤。[结论]米非司酮在病毒复制早期发挥抗病毒作用,与氢醌的联用具有更好的抗病毒效果,既减轻氢醌对肝脏的损伤,又弥补米非司酮药效上的不足。

猪伪狂犬病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区的克隆及序列分析

为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆与序列分析。结果表明:Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区全长为636 bp,与韩国Yangsan株和国内GDSH株核苷酸同源性较高,分别为99.4%和99.2%;与韩国Yangsan株和国内GDSH株、HNJZ株氨基酸同源性较高,均为98.6%。说明该分离株与韩国Yangsan株和国内GDSH株具有较近的亲缘关系。

山柰提取物的制备及其体外抗伪狂犬病毒活性研究

【目的】研究山柰提取物在体外抑制伪狂犬病病毒活性。【方法】通过响应面法优化山柰的超声提取工艺,并用荧光定量PCR法检测山柰提取物抗病毒的作用方式及其作用时间点。【结果】以黄酮含量作为响应值,优化得到最佳制备工艺:溶剂为80%乙醇,功率208 W,提取98 min;抗伪狂犬病毒活性研究表明:山柰提取物对伪狂犬病毒的半数抑制质量浓度(IC50)为55.85μg/mL,作用方式为抑制病毒的穿入和复制阶段,在病毒感染24 h内加入山柰提取物均表现出显著的抗病毒活性。【结论】山柰提取物具有显著的体外抗伪狂犬病毒活性。

新型含N-吡啶联吡唑类二聚体衍生物的合成及抗猪伪狂犬病毒(PRV)活性评价

猪伪狂犬病毒(PRV)不仅感染多种脊椎动物,还可直接感染人类,导致神经和呼吸系统严重受损,引起了人们对PRV跨物种传播的担忧,然而,针对PRV的特异性抗病毒药物很少.运用分子拼接和电子等排的原理,设计合成了25个含N-吡啶联吡唑类二聚体衍生物,并测试了目标化合物对PRV病毒的抑制效果.初步生物活性测试数据显示,大多数化合物在10μmol/L浓度下表现出较强的抗PRV病毒活性,且对猪源肾上皮细胞(PK-15)具有无毒性或者低毒性.此类新型含N-吡啶联吡唑类二聚体衍生物可作为潜在抗PRV病毒的先导化合物进一步优化和开发.

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

为了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。pPICZαA-PIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFN-β,其中B1株酵母的PoIFN-β产量最高,约为2.5×105U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×106U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFN-β阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFN-β理论推导分子量(约20.8kDa)大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFN-β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFN-β对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

建立可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对30份疑似病料进行临床检测。本研究所建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×10拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应,具有高特异性;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。

可视化LAMP快速检测猪伪狂犬病毒

为快速检测猪伪狂犬病毒(PRV),利用PRV DBP基因上的一段序列设计并合成3对LAMP引物,采用一种新的荧光染料——罗丹明B衍生物作指示剂,该指示剂在反应前加到反应缓冲液里,通过优化反应条件,建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法。结果表明,63℃下恒温反应40min可得到肉眼可视结果,颜色变成蓝色判定为阳性,仍然保持紫色判定为阴性,可视化LAMP结果与电泳结果一致。建立的可视化LAMP方法可以快速、直观、准确地检测PRV。

猪伪狂犬病毒Guizhou-DY株gE基因的克隆及生物信息学分析

为了研究伪狂犬病毒gE蛋白的结构及其在免疫保护中的功能,试验根据GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)GDSH株(登录号为EF552427)gE全基因序列设计引物,对伪狂犬病病毒gE基因进行PCR扩增、克隆及生物信息学分析。结果表明:PCR扩增基因全长1 734 bp,编码577个氨基酸,与Yangsan株对应序列同源性为99.4%,测序结果已提交GenBank,登录号为JX417716;Guizhou-DY株gE蛋白是一种不稳定的疏水性蛋白,柔性区域呈散在性分布,以T转角和无规则卷曲为主,具有2个疏水区,在100～400位氨基酸残基处抗原性指标较高,基因序列保守性强;经预测,gE全基因不能在大肠杆菌表达系统中得到高效表达。

广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告

为了解广西猪伪狂犬病毒的感染状况,应用PCR技术对来自广西46个种猪场的1940份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,阳性率为0;同时对广西25个已使用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗猪场的1455份送检血清,采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测,结果检出猪伪狂犬gE抗体阳性11份,阳性率为0.76%。结果表明,广西猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染,但感染率较低。

贺州市规模养殖场种猪伪狂犬病毒抗体水平检测与分析

为了评估2020年度贺州市规模养殖场种猪伪狂犬病毒免疫抗体水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对贺州市多个地区规模养殖场采集的480份种猪血清样品进行猪伪狂犬病毒(PRV)gB抗体检测。检测结果发现:480份种猪血清样品PRV gB抗体阳性率为76.7%,其中后备母猪抗体阳性率为66.3%,经产母猪抗体阳性率为86.9%,种公猪抗体阳性率为76.9%。综上结果分析表明,后备母猪、经产母猪和种公猪PRVgB抗体水平存在差异,其中经产母猪PRV gB抗体阳性率较高,而后备母猪PRV gB抗体阳性率相对较低。

猪伪狂犬病毒引起PK-15细胞自噬的研究

[目的]研究猪伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾传代细胞系(PK-15)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬在PRV感染复制过程中的作用。[方法]采用Western blot、透射电子显微镜(TEM)、激光共聚焦、siRNA转染等方法研究了PK-15细胞感染PRV后的细胞自噬。利用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分析自噬对病毒复制的影响,再通过沉默自噬相关基因Beclin-1,进一步观察自噬对PRV复制的影响。[结果]PRV感染PK-15细胞后,LC3-Ⅰ显著转化为LC3-Ⅱ,PK-15细胞内自噬小体的数量明显增加。PRV感染增加了LC3阳性斑点的细胞数。同时,变异毒株PRV ZJ01与传统毒株PRV LA诱导的自噬存在差异。自噬的药理学变化试验和siRNA转染结果还显示自噬能够促进PRV的复制。[结论]PRV感染PK-15细胞可以诱导自噬并有利于病毒的复制。

猪伪狂犬病毒体外诱导RAW264.7细胞炎症反应模型的建立

【目的】探讨猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症反应的影响,确定PRV的最佳感染剂量和感染时间,为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5~10-1 PRV稀释液,感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h,弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养,分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液,采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶(COX-1和COX-2)活性,并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4~48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带,故选择4~48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV~10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性(P<0.05,下同),10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势,而10-5 PRV~10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后,其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势,其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著(P<0.01)提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV~10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势,而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组,至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV~10-1 PRV感染8~24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性,但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应,其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8~12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究,为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。

螺旋藻多糖对猪伪狂犬病毒感染小鼠血清中氧化应激相关因子的调节作用

试验旨在探究螺旋藻多糖(Spirulina platensis polysaccharide,PSP)的抗氧化作用,首先经过酶解水提法得到螺旋藻多糖,然后经过DEAE-52纤维素层析柱和Sephacryl S-200凝胶层析柱分离纯化后得到螺旋藻多糖组分1(PSP-1)。将小鼠分为3个不同剂量药物组(200、100 mg/kg·BW和50 mg/kg·BW)、猪伪狂犬病毒(PRV)组和对照组共5个组别(A、B、C、D、E组)进行试验,采用试剂盒法测定小鼠血清中一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和丙二醛(MDA)的分泌水平以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、髓过氧化物酶(MPO)、黄嘌呤氧化酶(XOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果表明:在使用了不同剂量的药物之后,血清中NO、MDA水平和MPO活性均极显著降低(P<0.01);iNOS、XOD活性在A组和B组均极显著降低(P<0.01);同时,血清中SOD活性均极显著升高(P<0.01);GSH-Px活性和CAT活性在A组和B组极显著升高(P<0.01),在C组显著升高(P<0.05)。由此可见,PSP-1能够缓解PRV感染小鼠引起的氧化应激,具有一定的抗氧化性,可为动物病毒性疾病的治疗提供思路。

猪肿瘤坏死因子受体相关因子6的克隆、表达及对伪狂犬病病毒的抑制效应

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是天然免疫信号通路中重要的接头分子,笔者旨在探索猪TRAF6的抗病毒和免疫调控功能。首先利用RT-PCR从猪外周血单核细胞克隆该基因,并进行序列比对分析;其次利用Piggybac转座子系统建立猪TRAF6稳定表达的PK-15细胞系;最后在细胞水平检测猪TRAF6对伪狂犬病病毒复制的影响以及对猪IFN-β等启动子活性的影响。结果显示,猪TRAF6基因为1 623bp;将猪TRAF6基因连接到Piggybac转座子质粒成功构建真核表达载体PB-TRAF6,然后将重组质粒转染PK-15细胞,经药物处理和荧光筛选获得稳定表达TRAF6的细胞系;通过荧光定量PCR和Western blot确定稳定细胞系TRAF6的高效表达;体外抗病毒试验表明,TRAF6稳定细胞系能够显著抑制伪狂犬病病毒的复制;双荧光报告基因法检测发现,TRAF6可以促进poly(I:C)诱导的Ⅰ型干扰素应答。结果提示猪TRAF6具有显著的抗病毒和免疫调节功能,为研究TRAF6的免疫学功能奠定基础。

猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3种病原体的基因保守序列,分别设计了3对检测引物。在建立各病毒单项PCR技术的基础上,用这3对引物对人为混合的样品中的PPV、PRV和PCV2的DNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应条件的优化,结果同时得到3条与试验设计相符的251bp(PPV)、375bp(PRV)和493bp(PCV2)特异性条带。对20份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单项PCR检测对比检测试验的符合率为100%,表明建立的多重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。

崇阳县猪伪狂犬病毒感染调查

为了解湖北省崇阳县猪伪狂犬病毒的感染状况,应用PCR技术对来自崇阳县不同规模7个种猪场的126份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,阳性率为0;同时采取了这7个已使用猪伪狂犬病病毒g E基因缺失疫苗免疫血清420份,采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测,结果检出猪伪狂犬g E抗体阳性10份,阳性率为2.37%。结果表明,崇阳县猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染,但感染率较低,不同猪场感染差异大。

他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】他莫昔芬用药浓度在6μmol/L时对细胞活力无影响;在6μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响(P>0.05)。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组(P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达(P<0.01);Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达(P<0.05;P<0.01);病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组(P<0.05;P<0.01)。【结论】他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。

Neuropilin-1与Furin:决定伪狂犬病毒毒力的关键宿主基因

猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是危害养猪业的重要动物传染病之一。猪是伪狂犬病毒的天然宿主。近年来,越来越多的证据表明PRV可实现跨种间传播感染人,对人类健康构成潜在的威胁,尤其是在2011年以后猪伪狂犬病毒变异毒株的爆发。PRV完成生命周期的复制不仅依赖于病毒自身编码的关键蛋白,也依赖于重要的宿主蛋白来完成。因此,寻找与PRV编码蛋白相互作用的重要宿主蛋白对阐明PRV的发病机制以及抗病毒治疗至关重要。PRV gB是最保守的囊膜糖蛋白,与人单纯疱疹病毒1(HSV-1)的gB蛋白有50%的氨基酸序列同源性。

陶氏化学格利特消毒剂GLUTEX GS2对伪狂犬病毒杀灭效果的测试

本研究参照美国国家环境保护局(EPA)关于消毒剂在干燥的非生物表面的抗病毒效果测评方法,评定了美国陶氏化学公司的格利特消毒剂GLUTEX GS2对伪狂犬病毒的杀毒效力。结果表明:经合成硬水1:256倍稀释的格利特消毒剂GLUTEX GS2,在与干燥处理的伪狂犬病毒膜充分接触10 min后,病毒活性低于0.5个滴度,表明此消毒剂对伪狂犬病毒具有杀灭效力,可用于此病毒的日常消毒中。