大黄与小鼠小肠抗生素肽表达变化的相关性研究

目的通过观察大黄对正常小鼠小肠抗生素肽(antimicrobial peptide,AP)的作用,研究大黄与小肠AP之间的相关性。方法将30只健康ICR小鼠随机分为实验组和对照组,每组15只,分别给予10%大黄煎剂及等量的生理盐水灌胃。24h后处死小鼠,剖腹切取从屈氏韧带到回盲部的小肠。以10%乙酸溶液冲洗肠腔收集灌洗液,并以30%乙酸溶液制备小肠组织匀浆。称取等量的乙酸溶解物分别进行12·5%酸性尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)、Tricine-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-16·5% SDS-PAGE),考马斯亮蓝R-250或氨银染色显示多肽条带,然后进行凝胶成像分析和电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌实验(gel overlay assay)。比较两组标本的杀菌活性、小肠AP表达的变化,测定小肠AP的分子量。结果大黄灌胃后,小鼠小肠匀浆的AP含量变化不明显,但是AP分子量不同;而小肠灌洗液中AP含量增加明显,分子量介于14·3～18·4kDa;但是其杀菌能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0·05)。结论大黄可增加小肠部分AP表达,这可能是大黄保护、增强肠道屏障的作用机制之一。

小鼠小肠抗生素肽的初步分离

目的初步分离小鼠小肠抗生素肽。方法将12只健康ICR小鼠剖腹切取从屈氏韧带到回盲部的小肠,以10%乙酸溶液冲洗肠腔收集灌洗液,并以30%乙酸溶液制备小肠组织匀浆,反复离心,聚乙二醇浓缩后透析,冰冻干燥,进行AU-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色或银染显示多肽条带,然后进行凝胶成像分析和杀菌试验。结果小鼠小肠组织匀浆和灌洗液中均含有可杀灭细菌、真菌的抗生素多肽,其中组织匀浆中所含的此类多肽较多;小鼠小肠抗生素肽的杀菌作用具有剂量依赖关系,且对不同细菌、真菌的杀灭作用也不同;小鼠小肠抗生素肽的分子量主要集中于3.0kD～14.3kD和29.0kD。结论小鼠小肠含有多种抗生素肽,具有广谱的杀灭微生物的作用。

抗生素肽——一种新型饲料添加剂

由于药物残留和耐药性问题,许多传统抗生素被限制使用。抗生素肽作为一种新型肽类抗生素,具有广谱、无残留、不产生耐药性等优点,很可能成为新型抗生素的来源。文章简述了抗生素肽及其特点、作用机制以及作为饲料添加剂应用的优势和发展前景。

抗生素肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体的构建

细菌对传统抗生素产生耐药性是当今临床医学中的全球性难题之一。内源性抗生素肽是多细胞生物天然进化产生的抵御外源性感染的生物活性肽，历经数百万年而无耐受产生，且其作用迅速、强力、广谱。但是天然获取、固相合成和重组真核表达抗生素肽量少而造价极其昂贵，因此，利用微生物作为生物反应器通过基因工程技术生产抗菌肽，是进行抗菌肽研究开发的最有前途的选择之一。

内源性抗生素肽

内源性抗生素肽是指由基因编码的、动物(包括人类)细胞产生的抗菌分子,具广谱抗微生物活性,有的还有选择性肿瘤细胞毒性。其分子较小,肽链多在100个氨基酸以下。迄今已从不同种属动物(电虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、哺乳动物等)发现近100种。其基本的抗菌机制是:抗菌肽分子插入菌体外膜形成离子通道,胞外离子以依赖电压的方式进入胞内,引起菌细胞水肿而死亡。传统抗生素耐药菌株对其多无抗性。

人淋巴因子激活的杀伤细胞抗生素肽的分离纯化

目的 分离纯化人淋巴因子激活的杀伤细胞 (lym phokine activated killer,L AK)内源性抗生素肽。方法 采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞 ,并用 IL- 2和 PHA刺激培养。 5 %乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽 ,Tricine- SDS-PAGE鉴定其分子量 ,并运用琼脂糖弥散法鉴定其抗菌活性。结果 从人 L AK细胞酸溶性提取物中纯化出多个多肽 ,其中 HL P- 2 b、HL P- 3a完全纯化 ,分子量分别为 7.9× 10 3u和 4× 10 3u。HL P- 2 a、HL P- 2 c、HL P- 3b和 HL P- 3c基本纯化 ,主带分子量分别为 7.2× 10 3u、10 .4× 10 3u、6 .4× 10 3u、6 .4× 10 3u。 HL P- 3a具有抗金黄色葡萄球菌活性 ,HL P- 2 a、HL P- 2 b、HL P- 2 c、HL P- 3b、HL P- 3c具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗白色念珠菌活性。结论 人 L

粘膜抗生素肽与新抗微生物战略(文献与研究综述)

本文综述粘膜抗生素肽的研究进展及其应用前景展望。1 粘膜抗生素肽的研究进展 自90年代初发现爪蟾上皮细胞小分子抗菌肽Magainins以来,迄今已从牛气管粘膜纤毛柱状上皮细胞、牛舌鳞状上皮细胞、人肾小管上皮细胞、人皮肤上皮细胞等发现了β-防御素分子家族。从多种哺乳动物小肠隐凹Paneth细胞发现了α-防御素。我们的研究显示哺乳动物(包括人)膀胱粘膜亦存在抗菌多肽。

低能离子注入诱变法选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的为进一步提高产量,以小单孢菌Micromonospora sp.TMD166-MU1为出发菌株,采用低能离子注入技术,研究不同离子注入参数对菌株存活率、正负突变率的影响,通过突变株抑菌活性变势参数分析,初步探讨N+离子注入对166A生产菌所产生的诱变效果,并结合卡那霉素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选,获得高产菌株。方法利用低能N+离子注入技术对出发菌株TMD166-MU1的孢子进行辐照诱变,以卡那霉素耐受性为选择压力,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在含有卡那霉素培养基平板上培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法进行高产菌株初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用高效液相法检测突变株摇瓶发酵的化学效价。结果通过研究30和60 keV能量下不同注入剂量与小单孢菌正突变率的生物学效应关系,确定了在注入能量为30 keV、注入剂量4×10^(13)ions/cm^(2)、卡那霉素抗性筛选浓度为6 mg/L条件下,可获得最高达36.33%的正突变率。复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有4株,其中突变株IK-3的166A产量是菌株TMD166-MU1的1.8倍。结论采用低能N+离子注入诱变方式,再结合抗生素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选的集成方法能简单、高效地获得166A高产突变菌株。

分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的多肽类抗生素

试验基于分散固相萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱法,建立一种同时测定饲料中16种多肽类抗生素(PPTs)的定量分析方法。样品经1%三氯乙酸(aq)-甲醇溶液提取,十八烷基硅胶(C18)分散固相萃取净化后上机测定。在电喷雾正电离模式下,使用多反应监测(MRM)模式,基质匹配校正曲线定量。结果显示,PPTs在相应的浓度范围内线性关系良好,相关系数(R2)大于0.99,检出限为0.4~12.1μg/kg,定量限为1.4~40.4μg/kg。PPTs在饲料中的平均回收率(n=6)为80.0%~114.4%,相对标准偏差(RSD)为2.33%~9.51%。研究表明,该方法操作简单、准确可靠、灵敏度高、分析时间短且重现性高,可广泛应用于饲料中16种PPTs的快速筛查和常规监测。

超高效液相色谱联质语质中多肽类抗生素

使用0.45μm微孔滤膜过滤水样,然后加入Na2EDTA盐,除去部分金属离子,再调节pH值为3,使用Oasis HLB固相萃取柱富集净化,用5 mL、0.1%的甲酸甲醇和5 mL甲醇洗脱,经氮吹浓缩,以0.1%的甲酸乙腈和0.1%的甲酸水溶液为流动相,采用超高效液相色谱-串联质谱检测多肽类抗生素。检测结果表明,在标准曲线浓度范围内,11种多肽类抗生素线性关系r2均大于0.998,检测限均低于1 ng/L,进行低、中、高浓度加标,平均加标回收率在77.7%~98.1%之间,相对标准偏差在1.5%~14.2%之间。该方法操作简便、测试时间短、准确度和精确度好、检出限低,可以同时测定水质中11种多肽类抗生素。

芽孢杆菌脂肽类抗生素的抑菌活性及其对植物病害的生物防效研究

生物农药替代化学类农药和农药减量已成为农业可持续发展的必然趋势。为此,介绍了脂肽类抗生素的种类和结构以及脂肽类抗生素的抑菌活性,阐述了脂肽类抗生素在植物病害生物防治中的表现,探索了芽孢杆菌开发为生物农药方面的应用。

基于通过式固相萃取净化的液相色谱-串联质谱法测定猪肉中5种肽类抗生素

建立了一种基于免活化通过式固相萃取净化技术的液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)用于测定猪肉中5种肽类抗生素(达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素、维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1)。猪肉采用甲醇-2%甲酸(体积比为5∶2)进行提取,经免活化的Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱净化后,以Phenomenex Kinetex F5(2.1 mm×100 mm,2.6μm)色谱柱分离,0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸梯度洗脱。采用电喷雾离子源正离子模式扫描,多反应模式(MRM)监测目标物,内标法定量。结果表明,猪肉中达托霉素在2~200 ng/mL范围内,万古霉素及去甲万古霉素在5~500 ng/mL范围内,维吉尼亚霉素M1及维吉尼亚霉素S1在1~100 ng/mL范围内均呈良好线性关系,相关系数(r^(2))均大于0.99,5种肽类抗生素的检出限为3~7.5μg/kg,定量下限为5~25μg/kg。在25、50、250μg/kg 3个加标水平下的平均回收率为80.2%~102%,日内相对标准偏差(Intra-RSD)为1.3%~7.4%,日间相对标准偏差(Inter-RSD)为2.6%~8.5%。该方法基于Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱免活化净化,前处理简便,回收率好,重复性佳,适用于猪肉中5种肽类抗生素的同时检测。

基于通过式固相萃取净化的液相色谱-串联质谱法测定猪肉中5种肽类抗生素

本研究采用通过式固相萃取净化为前处理添加,借助液相色谱-串联质谱法,构建了猪科动物家猪肉中5种肽类抗生素的测定方法。研究表明,通过式固相萃取净化的液相色谱-串联质谱法,可以用于测定猪肉中的肽类抗生素。

一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达

目的 通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法 根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果 设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论 设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

多肽抗生素apidaecin基因在乳酸乳球菌中的融合表达

利用乳链菌肽 (nisin)诱导表达系统 ,以泛素 (ubiquitin)融合蛋白的形式在乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)中表达了多肽抗生素apidaecin。利用Tricine SDS PAGE和Westernblotting均可在诱导后的宿主菌中检测到特异蛋白带。表达产物的最高产量可达宿主菌可溶性蛋白的 7 2 %左右。在体外用泛素特异性蛋白酶UBPI从融合蛋白中切除泛素后 ,产物具有明显的抗菌活性。

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

生防芽胞杆菌脂肽抗生素研究进展

本文对生防芽胞杆菌脂肽抗生素的类群、特性,脂肽抗生素合成相关基因的基因工程研究以及脂肽抗生素的分离纯化、鉴定进行了概述。最后对该类抗生素的研究前景进行了展望。

肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探

目的 : 构建肽抗生素hPAB β基因多拷贝串联体重组质粒 ,实现目的基因串联产物在大肠杆菌中的高效表达。 方法 :以表达质粒pQE 32为载体 ,利用同裂酶PstⅠ与AvaⅢ能产生相同粘端的特性 ,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等操作 ,构建含不同数目hPAB β基因的串联体。对获得的重组菌用异丙基巯基半乳糖 (IPTG)诱导表达 ,Tricine SDS PAGE观察串联体融合蛋白的表达情况。 结果 :构建了一至八拷贝的串联体重组质粒 ,经酶切、DNA测序分析表明 ,各串联体的DNA序列及阅读框完全正确。Tricine蛋白电泳显示 ,各串联体的阳性转化菌株经IPTG诱导后均能表达出目的融合蛋白 ,相对分子质量与预期结果相符 ,表达量占细菌总蛋白的 1 0 %～2 2 %。但八拷贝较其他串联体表达率有所降低。 结论 :hPAB β基因串联体重组表达质粒的成功构建 ,为大量制备目的肽抗生素奠定了基础 ,并为其他小分子生物活性肽的制备提供了参考。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。