水稻品种稻瘟病抗性和抗病基因同源序列多态性分析

【目的】明晰水稻抗瘟性表型和抗病基因同源序列多态性之间的关系,了解广谱、持久抗瘟性的分子遗传基础。【方法】利用25个稻瘟病鉴别品种(系)和20个水稻品种(系)在人工接种条件下的对稻瘟病单孢菌株的抗性表型和抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGA)多态性进行聚类比较分析。【结果】以单孢菌株接种的抗性表型聚类,取相似系数0.450,可将45个品种(系)划分为A、B两大类;取相似系数0.618,A、B两大类又分别可分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ等4个亚类。以抗病基因同源序列多态性聚类,取遗传相似系数0.620,可将45个品种(系)划归Ⅰ,Ⅱ两类,这两类明显地趋向籼粳两亚种划分;取遗传相似系数0.783时,类群Ⅰ又可划分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ等6个亚类,类群Ⅱ又可划分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ、ⅶ等7个亚类。用抗感单孢稻瘟病菌表型聚类,倾向于抗谱相似的聚为一类;按RGA相似性聚类,倾向于遗传背景相近的聚为一类。对于抗病频率低或是抗病频率高的品种两者类与类之间有较好的对应关系,但总体看来类与类之间没有明显的对应关系。【结论】在抗稻瘟病育种方面,对亲本材料进行单孢菌株抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析,可以更准确地反映亲本抗性遗传背景,从而避免同一抗源反复使用,还可以丰富培育品种的抗性遗传基础和延长品种抗性。

甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物,从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列,其中5条来自基因组DNA(EF059973、EF059974、EF059975、EF059976和EF059977),6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明,这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域。聚类分析表明,11条RGA同RPS2和XA1聚为一类,而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中,kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明,编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响,而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制,也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。

植物抗病基因同源序列及其在抗病基因克隆与定位中的应用

近 10年来已有 2 0多个植物抗病基因被克隆、测序 ,这些抗病基因所编码的蛋白中大多含有核苷酸结合位点、富含亮氨酸重复序列、蛋白激酶、亮氨酸拉链结构、跨膜结构域、Toll白介素 - 1区域等保守结构域。利用这些保守结构域合成PCR引物 ,已扩增出大量的植物抗病基因同源序列 (RGA)。对RGA与抗病基因的关系进行了分析 ,讨论了RGA在研究抗病基因进化中的作用 ,指出RGA在抗病基因定位和转基因中具有重要意义。

中国野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】通过同源克隆法从刺葡萄‘高山2号’叶片中得到抗白腐病基因的同源片段,为筛选葡萄抗白腐病基因奠定基础。【方法】根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守区设计简并引物,从高抗葡萄白腐病刺葡萄‘高山2号’的基因组DNA与cDNA上得到抗病基因同源片段(RGAs),并对其表达分析进行检测。【结果】从刺葡萄‘高山2号’上获得了10个NBS-LRR类抗病基因同源片段,10条葡萄RGAs间在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性,进一步分析发现,在10条葡萄RGAs中,4个推测所属基因为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,6个所属基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。定量PCR分析表明,NB7基因受到白腐菌的诱导,而且NB7基因在刺葡萄叶片中为低丰度表达,NBS6基因受到白腐菌的诱导后为下调表达。【结论】在刺葡萄上成功获得了抗病基因同源序列,通过荧光定量PCR分析发现,NB7基因与NBS6基因都受到白腐菌的诱导表达,为最终克隆得到葡萄抗白腐病基因奠定基础。

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。

烟草表达抗病基因同源物(RGA)的鉴定及RGA-SSR标记的开发

烟草是研究植物与病原菌互作的理想材料。鉴定烟草抗病基因及其同源物对揭示抗病机制具有重要意义。近年来公共数据库不断增长的EST序列为烟草表达RGA的鉴定提供丰富的数据。本研究通过拼接GenBank收录的412325条烟草EST序列，获得149606条Uni．EST序列。随后利用已克隆的112个植物R基因蛋白序列对其扫描，检测出1113个NtRGA，其中有273、546、53、102和30个分别包含NBS-LRR、LRR．PK、LRR、PK和Mlo结构域，另有109个未检测到结构域。通过序列比对将1071个NtRGA定位于Ⅳ．benthamiana基因组712个位点上。经搜索，从72个NtRGA中检测出78个SSR，根据其侧翼序列设计64对引物。54对成功从烟草基因组DNA中扩增出清晰条带，9对在24个普通烟草品种间检测出多态性，检出等位基因数2～4个，平均2．56个；41对在6个烟草种间检测出多态性，检出等位基因数2～4个，平均2．61个。

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

目的利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。方法根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物,对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。结果获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现,该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示,该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多拷贝。结论本研究成功获得了不结球白菜RGA序列,为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。

基于NBS-LRR类R基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列

【目的】分离鉴定瓠瓜Lagenaria siceraria抗病种质的抗病基因同源序列（Resistance gene analogs,RGAs）,为瓠瓜功能性抗病基因的克隆及分子标记辅助育种奠定基础.【方法】根据已知核苷酸结合位点和富亮氨酸重复（Nucleotide binding site and leucine rich repeat,NBS-LRR）类抗病基因保守区设计简并引物,从“大籽瓠”抗性材料基因组DNA中分离抗病基因同源序列,并利用生物信息学软件进行长度变异、保守结构域、同源比对与系统进化分析.【结果和结论】基于同源克隆策略,获得23条瓠瓜NBS抗病同源序列,命名为HNB1～HNB23,GenBank登录号为KJ908192～KJ908214.序列分析及同源比对结果表明,这些RGAs长度变异在242～261nt之间,18条序列具有连续开放阅读框（Open reading frame,ORF）,推导氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS类R基因保守结构域;核苷酸序列相似性为41.5% ～98.8%,氨基酸序列相似性为21.5% ～100.0%;利用NCBIBlast同源搜索发现,与其他植物尤其是冬瓜、黄瓜、葫芦及丝瓜的已知R基因具有40% ～100%相似性;氨基酸序列聚类分析将其分为5个组;同源进化分析表明,23条瓠瓜RGAs均为non-TIR-NBS-LRR类R基因,与推导氨基酸序列多重比较结果一致.

棉花多抗品种中植棉KV-1抗病基因同源序列的克隆与分析

许多抗病基因都具有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop(kinase-1a)、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS-LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%～60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%～60%。这些抗病基因同源序列(RGAs)可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。

斑茅NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知NBS-LRR抗病基因[含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因]NBS结构域蛋白质的保守序列,设计简并引物,对斑茅基因组进行体外扩增,获得了对应区段的DNA片段,回收、克隆这些特异片段,测序分析,共获得8个片段序列。序列分析发现其中7个编号分别为RGA-Q1、RGA-Q2、RGA-Q3、RGA-Q4、RGA-Q5、RGA-Q6和RGA-Q7的片段推导的氨基酸序列均具有典型的NBS结构域,即P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)、Kinase-3a(GSR/KILVTTR)及疏水结构域HD(hydrophobic domain)。它们在NCBI上的登录号为EU685828、EU685829、EU685830、EU685831、EU685832、EU685833和EU685834。这些抗病基因同源片段(RGA)与已经克隆的N、L6、RPS2和Mi等11个抗病基因在氨基酸水平上的同源性为2.3%～39.8%,可进一步用作斑茅抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增出3条与植物抗病基因同源的序列,分别为WRGA1、WRGA2和WRGA14。这三条同源片段均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守性结构域Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD)．它们与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为46．0%-9．9%,三个片段间在氨基酸水平上的同源性为80．7%-56．8%。Northern杂交表明WRGA1在小麦中受水杨酸正调控,属诱导型表达。

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。

甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究

根据植物抗病基因保守序列设计特异引物,对甘薯高抗茎线虫病品种AB94078-1、感病品种徐18及其8个后代品系进行PCR扩增。获得15个具有完整氨基酸读码框的片段,均具有NBS类抗病蛋白4个保守基序,其中5个片段含LRR结构。利用从亲本AB94078-1扩增的R510-AB作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多个拷贝,并估计其在基因组中的拷贝数目,克隆新的甘薯RGA序列,为进一步获得甘薯抗病基因打下基础。

晚熟温州蜜柑NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

为加深对柑橘黄龙病抗性机理的了解和为黄龙病抗性基因的克隆提供依据,根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以柑橘黄龙病抗性品种＂晚熟温州蜜柑＂为供试材料,对其基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,结果共获得17条抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,其在NCBI中的登录号为KJ019189~KJ019199,KR815564~KR815569。序列分析表明,这17个RGAs与甜橙、柚等柑橘属中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有显著高的同源性。其中一些RGAs与拟南芥抗霜霉病RPP13基因、柑橘抗衰退病毒基因Ctv或烟草抗TMV基因N具有51.7%~79.0%的氨基酸序列同源性。依据论文结果,笔者认为,晚熟温州蜜柑中存在较丰富的NBS-LRR类抗病基因,但具体哪些病基因与抗黄龙病相关尚需进一步研究。

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析(英文)

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。

黑龙江水稻品种抗病基因同源序列聚类分析

利用拟南芥RPS2基因和烟草N基因的NBS -LRR区域设计的S1和AS3两个引物对 2 4个黑龙江粳稻品种基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析结果表明 :根据差异相似性 86 %为度可将供试品种划分为 3个类群。

斑茅cDNA中抗病基因同源序列的分离和表达特性分析(英文)

植物抗病基因具有一些特定的保守结构域。本研究根据已知植物同源抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物,从甘蔗近缘植物斑茅的cDNA中扩增出6条抗病基因同源序列,它们在NCBI上登录号分别为EU685835、EU685836、EU685837、EU685838、EU685839和EU685840。序列分析表明,这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因保守结构域P-loop、kinase-2a、kinase-3a和疏水结构域(hydrophobicdomain,HD)。氨基酸序列的同源性比对表明,6条RGAs序列同11条参试的抗病基因之间的同源性为8.3%～93.0%,而6条RGAs之间的氨基酸序列同源为30.5%～45.6%。另外,本实验所克隆的6条斑茅抗病基因同源序列中,kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸,推测所克隆的NBS-LRR类抗病基因都属于non-TIR-NBS-LRR类。定量PCR分析表明,6条斑茅抗病基因同源序列在根、茎和叶片中组成型表达,同时这些抗病基因同源序列的表达会受外源信号分子水杨酸和过氧化氢的上调作用,可能在斑茅的抗病性中具有一定的作用。

香蕉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物，从香蕉基因组DNA扩增出一条与植物抗病基因同源的序列，命名为BRGAl，该同源片段含有典型的NBS—LRR类抗病基因所拥有的保守性结构p-loop、Kinase-2a、Killase-3a和疏水结构域HD，它与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为23．8％-42．7％。Northern杂交表明BRGA1在香蕉中受水杨酸调控，属诱导型表达。

南瓜NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域合成相应简并引物,通过PCR扩增从南瓜基因组DNA中分离了8条南瓜抗病基因同源序列,通过对其编码的氨基酸序列分析表明这些RGAs均含有P-loop及GLPL等植物抗病基因中的保守结构域。经BLAST分析表明,分离的南瓜RGAs与已报道的甜瓜等植物的RGAs有较高的同源性。南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴。

植物抗病基因同源序列研究进展

以列表的形式,从引物设计、分离并登录GenBank的RGA数量、在连锁群中的分布、相关联的基因或位点等几方面综述了1995—2005所开展的各项抗病基因同源序列(RGA)研究,并对RGA的结构特征、分布与进化的特点、目前的应用现状、今后的研究前景及应注意的问题进行了评述。