水稻全基因组编码抗病基因同源序列分析

利用模糊搜索的方法,在TIGR水稻日本晴基因组数据库(TIGR Rice Genome Annotation-Release5)中识别出565个编码抗病蛋白质的同源序列;利用识别出565个编码抗病蛋白质序列分别与籼稻基因组数据库进行BLASTP联配,共确定320个对应的等位基因。通过在线生物信息学软件,识别了这565个抗病基因的保守结构域、保守模体和DNA序列内转座子元件,其中有14个抗病基因同源序列注释错误。同时绘出了这些基因的基因组分布,并基于这些基因的同源树分析和基因组物理分布,认为基因的原位和远程复制事件产生了抗病基因的现存分布和多样性,其中转座子在复制过程中扮演了重要角色。这些对抗病机制研究和抗病基因进化研究以及抗病基因的转育具有重要意义。

野生二粒小麦抗病基因同源序列分析

根据已知植物抗病基因编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计了6对特异筒并引物，对20份抗小麦白粉病野生二粒小麦的基因组DNA进行抗病基因同源序列克隆，共获得22条抗病基因同源序列（Resistance gene analogs，RGAs）。同源性比较发现，这22条RGAs均属于NBS-LRR类抗病基因类似序列，与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为6．1％～99．6％。同时，利用MEGA3．1将这22条序列划分为9类。本研究在野生二粒小麦中获得的RGAs既可进一步用于筛选野生二粒小麦的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于二粒系小麦遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术有望成为野生二粒小麦R基因克隆和基因组研究的重要手段。

云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析

根据已报道的NBS LRR类和STK类抗病基因结构中的氨基酸保守区域 ,设计简并引物 ,通过PCR扩增及克隆 ,从普通野生稻 (OryzarufipogonGriff.)、药用野生稻 (OryzaofficinalisWall.)、疣粒野生稻 (Oryzameye rianaBaill.)中共获得 14类NBS LRR类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 7类 ,药用野生稻中的有 2类 ,疣粒野生稻中的有 6类。药用野生稻中TO12代表序列与普通野生稻中TR19代表序列 ,同属一类 ,且具有 10 0 %的同源性 ,说明不同种野生稻中的同一类 (聚类 )抗病基因同源序列是完全一致的。同时 ,还获得 5类STK类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 4类 ;药用野生稻中的有 1类。通过氨基酸同源性比较分析 ,发现笔者克隆到的抗病基因同源序列与已克隆的抗病基因L6、N、Bs2、Prf、Pto、Lr10和Xa2 1等的氨基酸同源性都相当低 (均低于 2 5 % ) ,暗示了这些抗病基因同源序列可能是目前尚未报道的抗病基因的同源序列。

云南稻种抗病基因同源序列类似性分析

利用已知植物抗病基因和蛋白激酶序列中的保守区域设计的 3对引物对 137个水稻品种DNA进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明 ,水稻抗病基因同源序列类型丰富 ,以带型差异类似性 96 %为标准 ,这些品种可划分出籼粳差异较为明显的 3个类群 ;以带型差异类似性 6 0 %为标准 ,这些品种可划分为 2 0个类群。这些依分子标记划分的类群与品种的亲缘关系和抗瘟性基本一致。

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。

水稻抗病基因同源序列的克隆及测序分析

根据已知的 NBS- L RR类及丝 /苏氨酸蛋白激酶类抗病基因结构中氨基酸的保守区域 ,设计了两组简并引物用于扩增广谱抗稻瘟病品种云系 2号中的抗病基因同源序列。结果一共获得 11类的 NBS- L RR类抗病基因同源片段及 16类的丝 /苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源片段。所有 11类的抗病基因同源系列均含有 NBS- L RR类抗病基因的保守序列 ,如 P-loop、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜区域等。所有 16类的蛋白激酶的序列均含有丝 /苏氨酸蛋白激酶所共有的催化区 (共有氨基酸序列 :DL KPEN)、 (共有氨基酸序列 :GT/ SXXYXAPE)以及蛋白激酶的其他催化区。两条 NBS- L RR类的抗病基因同源片段 YR1、YR12分别与抗病基因 I2 C- 2及 Xa1氨基酸同源性很高 (>5 0 % )。7条丝 /苏氨酸蛋白激酶类的抗病基因同源片段与已克隆的 Xa2 1、Pto、L r10等抗病基因的氨基酸序列超过 6 0 %的相同以及 76 %～

水稻品种稻瘟病抗性和抗病基因同源序列多态性分析

【目的】明晰水稻抗瘟性表型和抗病基因同源序列多态性之间的关系,了解广谱、持久抗瘟性的分子遗传基础。【方法】利用25个稻瘟病鉴别品种(系)和20个水稻品种(系)在人工接种条件下的对稻瘟病单孢菌株的抗性表型和抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGA)多态性进行聚类比较分析。【结果】以单孢菌株接种的抗性表型聚类,取相似系数0.450,可将45个品种(系)划分为A、B两大类;取相似系数0.618,A、B两大类又分别可分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ等4个亚类。以抗病基因同源序列多态性聚类,取遗传相似系数0.620,可将45个品种(系)划归Ⅰ,Ⅱ两类,这两类明显地趋向籼粳两亚种划分;取遗传相似系数0.783时,类群Ⅰ又可划分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ等6个亚类,类群Ⅱ又可划分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ、ⅶ等7个亚类。用抗感单孢稻瘟病菌表型聚类,倾向于抗谱相似的聚为一类;按RGA相似性聚类,倾向于遗传背景相近的聚为一类。对于抗病频率低或是抗病频率高的品种两者类与类之间有较好的对应关系,但总体看来类与类之间没有明显的对应关系。【结论】在抗稻瘟病育种方面,对亲本材料进行单孢菌株抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析,可以更准确地反映亲本抗性遗传背景,从而避免同一抗源反复使用,还可以丰富培育品种的抗性遗传基础和延长品种抗性。

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

目的利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。方法根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物,对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。结果获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现,该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示,该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多拷贝。结论本研究成功获得了不结球白菜RGA序列,为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。

黄瓜抗病基因类似序列(RGA)的同源性分析和Southern鉴定

使用ClustalW和DNAMAN3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性,并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明:15个黄瓜RGA中,核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsR-GA4和CsRGA5,其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9,CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性;其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46%,最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物,用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在,其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针,与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交,证实了各个RGA在基因组上的存在,同时发现,CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝,其余为双拷贝。

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计 4对简并引物和 1对特异引物 ,以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料 ,应用PCR方法获得了 11条来自基因组DNA的RGA序列和 2条来自cDNA的RGA序列 ,序列长度在 5 0 0 - 6 33bp之间 ,其中 8条来自基因组DNA和 2条来自cDNA的RGA序列已在GeneBank登录 (登录号为 :AF30 5 388- 30 5 392 ,AY0 0 8380 - 0 0 8382 ,AY0 4 886 3-AY0 4 886 4)。 13条序列都不同程度的含有NBS保守区的P -环 (GGVGKTT)、kinase - 2 (VLDD)、kinase - 3(GSRII)及跨膜区GLPL等特征序列结构 ,由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPM 1、SRPS2、N编码的氨基酸序列表现出从 2 5 % - 42 %的同源性。本研究克隆的RGA序列根据其相似性可分为 4组 ,与已发表的大豆抗病类似基因 (RLG)具有较高的相似性。

百合品种抗病基因同源序列分析及抗枯萎病的鉴定

采用鳞片接种法对36个百合品种及5个野生种进行枯萎病(Fusarium oxysporumf.sp.lilii)接种鉴定,筛选抗性优异资源。结果表明:百合品种及野生种中蕴藏丰富的抗枯萎病种质资源。利用RGA-PCR方法对百合遗传多样性进行分析,10对RGA引物在41个品种及野生种中共扩增条带159条,其中多态带156条,占总带数的98.1%。以相似系数0.71聚类,41个百合品种及野生种划分为7类。抗性表型与RGA相似性聚类结果表明,利用品种的抗性表型聚类,趋于抗病性相近的聚为一类;利用RGA相似性聚类,趋于遗传背景相近的聚为一类。百合品种RGA的DNA指纹多态性与枯萎病抗性遗传表型多样性无明显的对应关系。对亲本材料进行抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析,能更准确地反映亲本的遗传背景,为百合枯萎病抗性基因鉴定及品种培育提供一定的理论依据。

芒果NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

根据已知物种NBS抗病类基因(RGAs)保守序列设计引物,从芒果品种金煌基因组DNA中分离得到了10条同源序列(pp-1～10,GenBank登录号为HM446507～16)。DNA序列分析表明,这些RGAs在200～300 bp区间存在较大变异,Pi值都在0.4以上。同源性分析表明这些序列的同源性差异范围从11.0%～98.4%,离散值范围为1.6～100.7,10条RGAs可以分为2大类。蛋白序列分析表明,pp-01～10都具有开放读码框,编码的蛋白含有典型的NBS抗病类基因所拥有的P-loop和Kinase-2a结构域,通过同源进化分析可将其分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR 2类,与已知物种同源性范围为20%～60.2%。

斑茅NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知NBS-LRR抗病基因[含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因]NBS结构域蛋白质的保守序列,设计简并引物,对斑茅基因组进行体外扩增,获得了对应区段的DNA片段,回收、克隆这些特异片段,测序分析,共获得8个片段序列。序列分析发现其中7个编号分别为RGA-Q1、RGA-Q2、RGA-Q3、RGA-Q4、RGA-Q5、RGA-Q6和RGA-Q7的片段推导的氨基酸序列均具有典型的NBS结构域,即P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)、Kinase-3a(GSR/KILVTTR)及疏水结构域HD(hydrophobic domain)。它们在NCBI上的登录号为EU685828、EU685829、EU685830、EU685831、EU685832、EU685833和EU685834。这些抗病基因同源片段(RGA)与已经克隆的N、L6、RPS2和Mi等11个抗病基因在氨基酸水平上的同源性为2.3%～39.8%,可进一步用作斑茅抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。

编码杧果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物，PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用Blast X比对发现，有6个阳性克隆是抗病基因同源序列，并命名为PK1～PK6，GenBank注册序列号为AY693369-AY693371和AY776277-AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ～Ⅸ，而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现，6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之，6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。

棉花多抗品种中植棉KV-1抗病基因同源序列的克隆与分析

许多抗病基因都具有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop(kinase-1a)、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS-LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%～60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%～60%。这些抗病基因同源序列(RGAs)可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。

黑皮冬瓜NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

以黑皮冬瓜＂B98K＂种质为试材,根据已克隆的植物NBS类抗病基因保守结构域设计简并引物,PCR扩增冬瓜基因组DNA,获得对应区段的DNA片段,回收克隆与测序后,得到19条抗病同源序列（命名为DNB1至DNB19）。利用DNAStar软件进行序列分析及同源性比对发现,这些抗病同源序列长度在249-252 nt之间,其核苷酸序列同源性在48.4%-98.8%之间,氨基酸序列同源性为23.2%-100.0%,推导氨基酸序列具有P-loop（GGVGKTT）、Kinase-2a（VLDDVW）典型的NBS保守结构域。同源进化分析将其全部归为non TIR-NBS-LRR类,与推导氨基酸序列多重比较结果一致;该序列与其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%-99.0%之间。该组序列已登录Genbank,登录号为KF776401-KF776419。

甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因(RGA),我们根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中821与324两个RGA为本研究首次发现.将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR类与TIR-NBS-LRR类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因.通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Prv存在于nbs47-3(MRGH11)与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv.

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。

野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析

为了挖掘野生稻中的抗病资源,根据已克隆的植物抗病基因核苷酸结合位点序列中的保守结构域设计3对简并引物,从疣粒、药用、高秆、宽叶和斑点野生稻基因组DNA中分离出13条NBS类抗病基因类似物,其中11条具有连续的ORF,具有NBS类R基因的保守基元P-loop、kinas-2、kinas-3a和GLPL。在NCBI上进行同源性搜索发现,其中12条RGAs的核苷酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有66%～94%的同源性,与其他植物已知R基因具有67%～84%的同源性;其对应的氨基酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有43%～93%的同源性,与其他植物已知R基因具有37%～79%的同源性。另外1条的核苷酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有76%的同源性,其氨基酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有74%的同源性。根据序列分析结果设计6对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,RN1BD5、RN1BD10、RN1GG2和RN1YY6均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;而RN1KY9和RN1GG5没有表达,可能是假基因。

黑龙江水稻品种抗病基因同源序列聚类分析

利用拟南芥RPS2基因和烟草N基因的NBS -LRR区域设计的S1和AS3两个引物对 2 4个黑龙江粳稻品种基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析结果表明 :根据差异相似性 86 %为度可将供试品种划分为 3个类群。