海岛棉NBS类型抗病基因类似物的起源、多样性及进化

利用已克隆植物的R基因NBS序列中保守模体合成简并引物 ,以海岛棉品系Pima 90 (Gossypiumbarba dense)基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,通过T A克隆、测序和序列比较分析共得到 31条RGAs ,其中 1 9条具有连续的ORF。利用海岛棉的 31条RGAs与GenBank中陆地棉种质系M 2 4 9(Gossypiumhirsutum)的RGAs进行了比较分析 ,RGAs可分为两大类 :其中第Ⅰ类全部为陆地棉的RGAs;第Ⅱ类分别包括了陆地棉和海岛棉的RGAs。同时对海岛棉RGAs的核苷酸和氨基酸序列进行系统发育树分析 ,表明海岛棉RGAs可分为TIR(DrosophilaTollorhumaninter leukinreceptor like)和non TIR两类 ,与前人所报道的R基因进化一致。对 1 9条具有连续ORF的RGAs进行了结构分析 ,结果表明它们包括P loop、Kin 2、“PLAL”及Meyers等所定义的RNBS A、B、C 3个模体。结果表明 。

甘薯NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析

利用已克隆植物抗病基因NBS(Nucleotidebindingsite)序列中的保守模体(motif)“P-loop”和“GLPL”合成简并引物,以甘薯(Ipomoeabatatas)栽培品种青农2号基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过T/A克隆、测序和序列分析,共得到15条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistancegeneanalogues,RGAs)序列,它们之间核苷酸序列间的相似性系数在41.2%-99.4%之间,而相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在20.6%-100%之间,同时对分离的RGAs的核苷酸和氨基酸序列进行系统发育树分析,表明甘薯RGAs可分为TIR(DrosophilaTollorhumaninterleukinreceptor-like)和nonTIR两类。对甘薯RGAs和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括“P-loop”、“Kinase-2”、“Kinase-3a”“、GLPL”4个抗病基因所共有的保守模体。这些表明甘薯与其它物种的NBS类RGAs可能具有同样的起源和进化机制。

花生栽野杂交后代抗病基因类似物的克隆与分析

【目的】在花生野生种、栽培种及栽野杂交后代中,克隆抗病基因类似物(Resistance gene analog,RGA)相关基因片段,为抗病基因的进一步分离、鉴定及利用奠定基础。【方法】以14个花生栽野杂交种和2个抗病花生亲本为材料,应用PCR方法扩增来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,并分析其同源性。【结果】扩增出15条来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,序列长度在500bp左右,由此推导出的15条氨基酸序列含有典型的NBS保守区的N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点。15条花生RGA氨基酸序列间的同源性在73.2%~100.0%,与已发表的花生抗病基因类似物的相似性较高,达72.1%~100.0%;与已知的其他作物的抗病基因编码的氨基酸序列有34.1%~54.6%的同源性。【结论】分离到的15个花生抗病基因同源片段为抗病基因的部分序列。

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS(Nucleotide binding site)类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型(R),其相对抗性指数在0.63—0.82;有5个优系为中抗类型(M),相对抗性指数在0.27—0.56;有10个为感病类型(S),相对抗性指数在0.00—0.21。PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它15个优系(5个中抗优系和10个感病优系)中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%—100%同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%—99%,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%—66%。氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性(Pi)明显低于非保守区,有较高保守性。系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00—0.95,为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%—63.5%,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%—48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择。

多花黑麦草抗病基因类似物的克隆及CAPS标记

多花黑麦草具有适应性强、生物产量高和品质好等优点,为我国南方及其他温带地区重要的牧草。本研究利用目前已克隆出的抗病基因(R基因)所编码的蛋白质结构上所具有的共同氨基酸基序NBS-LRR设计寡核苷酸简并引物,对多花黑麦草基因组进行抗病基因类似物(RGA)克隆。从克隆中筛选出具代表性的RGA克隆115个,设计RGA-STS引物113对。利用细胞质雄性不育(CMS)F1群体对RGA-STS引物进行筛选,并采用限制性内切酶酶切扩增多态序列(CAPS)法进行抗病类似物的分子标记,共检测到22对RGA-STS引物的扩增产物具多态性,22个RGA-CAPS标记均被标记于多花黑麦草遗传连锁图中。结果还表明RGA在多花黑麦草遗传连锁图中分布范围较广,并具有簇状分布特性。

海岛棉抗病基因类似物与防卫基因类似物的分离及特征分析

利用已克隆的抗病基因（resistance-gene, R基因）与病程相关蛋白基因β-1,3-葡聚糖酶基因（PR2）的保守序列设计简并引物, 从海岛棉品种海7124基因组中成功分离了79条核苷酸结合位点（NBS, nucleotide binding site）类R基因类似物（RGAs, resistance gene analogs）, 21条丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STK, Serine/Threonine kinase）类RGAs和11条防卫基因类似物（DGAs, defense gene analogs）. 将NBS类RGAs与棉花中已经克隆的该类RGAs进行序列分析, 鉴定了1个新的亚族. 具有连续ORF的48条NBS类RGAs和20条STK类RGAs分别可以划分为TIR-NBS与non-TIR- NBS两个亚类和A与B两个亚类. DGA中有4条具有连续的ORF. 对这些具有连续ORF的序列进行表达分析发现, 6条NBS类与1条STK类RGA受黄萎病菌诱导表达, 1条DGA经黄萎病菌诱导后表达量明显提高. 随机选取的4条TIR类与4条non-TIR类NBS类RGAs中有3条呈现2～3条杂交带, 其余的都有5～10条或以上的杂交带. 可见, NBS类RGAs大多数以多基因家族的形式存在. 另外, 有3条non-TIR类NBS类RGAs出现了一样的杂交带型, 可能这3条RGAs在基因组中成簇分布.

小麦NBS类抗病基因类似序列的多样性和进化关系研究

利用已克隆植物抗病基因NBS(Nucleotide binding site)序列中的保守结构P-loop和GLPL合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增。得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistancegene analogues,RGAs)序列,它们之间相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.9%～98.3%之间。对甘薯RGAs和4个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构。同时对分离的RGAs的氨基酸序列进行系统发育树分析,这些RGAs与Xa1、RPS2聚在一起,并且符合nonTIR RGAs类型。这些结果表明小麦与其他物种的NBS类RGAs可能具有同样的起源和进化机制。

香蕉抗病基因类似序列(RGA)的克隆与分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料IN21(Musa spp.cv.'IN21',AA)和Rose(M.spp.cv.'rose',AAA)的基因组DNA中扩增获得4个RGA,四条DNA片段长度分别为527 bp、537 bp、534 bp和547 bp,分别命名为"RGA-IN1"、"RGA-IN2"、"RGA-Rose1"和"RGA-Rose2"(GenBank Accession:EF488469、EF488470、EF488471和EF488472);同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因。

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计 4对简并引物和 1对特异引物 ,以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料 ,应用PCR方法获得了 11条来自基因组DNA的RGA序列和 2条来自cDNA的RGA序列 ,序列长度在 5 0 0 - 6 33bp之间 ,其中 8条来自基因组DNA和 2条来自cDNA的RGA序列已在GeneBank登录 (登录号为 :AF30 5 388- 30 5 392 ,AY0 0 8380 - 0 0 8382 ,AY0 4 886 3-AY0 4 886 4)。 13条序列都不同程度的含有NBS保守区的P -环 (GGVGKTT)、kinase - 2 (VLDD)、kinase - 3(GSRII)及跨膜区GLPL等特征序列结构 ,由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPM 1、SRPS2、N编码的氨基酸序列表现出从 2 5 % - 42 %的同源性。本研究克隆的RGA序列根据其相似性可分为 4组 ,与已发表的大豆抗病类似基因 (RLG)具有较高的相似性。

野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析

为了挖掘野生稻中的抗病资源,根据已克隆的植物抗病基因核苷酸结合位点序列中的保守结构域设计3对简并引物,从疣粒、药用、高秆、宽叶和斑点野生稻基因组DNA中分离出13条NBS类抗病基因类似物,其中11条具有连续的ORF,具有NBS类R基因的保守基元P-loop、kinas-2、kinas-3a和GLPL。在NCBI上进行同源性搜索发现,其中12条RGAs的核苷酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有66%～94%的同源性,与其他植物已知R基因具有67%～84%的同源性;其对应的氨基酸序列与水稻已知的NBS类R基因具有43%～93%的同源性,与其他植物已知R基因具有37%～79%的同源性。另外1条的核苷酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有76%的同源性,其氨基酸序列与水稻假定的NBS类R基因具有74%的同源性。根据序列分析结果设计6对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,RN1BD5、RN1BD10、RN1GG2和RN1YY6均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;而RN1KY9和RN1GG5没有表达,可能是假基因。

海岛棉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与定位

植物R基因产物存在非常类似的结构域 ,如NBS、LRR、STK、LZ、TM、TIR等。依据保守序列设计引物寻找抗病基因类似物 (ResistanceGeneAnalog ,RGA) ,从而定位或克隆抗病基因在理论上是可行的 ,这种方法称为R基因同源克隆法。RGA往往与已知抗病基因具有很高的相似性 ,均含有LRR、NBS或蛋白激酶中的保守基序 ,有的与已知抗病基因连锁 ,或是抗性基因家族中的成员 ,抑或与已知抗病基因无关 ,它们最有可能参与植物抗病反应过程中的信号识别、信息传导等途径 ,并且与植物抗病基因具有密切的关系 ,但RGA并非等同于植物R基因。将RGA作为分子标记整合到植物分子连锁图谱中 ,或将其作为探针筛选基因组文库 ,获得候选抗病基因则不失为一条克隆基因的捷径。利用已知R基因的保守序列设计引物进行PCR扩增 ,已经在植物中分离到了许多与已知R基因同源的DNA序列 ,并且有很多RGA作为标记定位在抗病位点附近 ,有点被证明与抗病性状共分离。小麦抗叶锈基因Lr10的分离是利用该方法进行抗病基因克隆的首次报道。本研究依据N ,L6 ,RPS2等NBS类抗病基因的NBS保守区设计简并性引物扩增棉花基因组DNA ,在 5 17bp左右获得特异性扩增条带。回收PCR产物 ,连接转化共得到 80 0个克隆。经酶切筛选、嵌套引物鉴定获得 2 5 2个候选RGA克隆。

海南普通野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与分析

为研究海南普通野生稻中的STK类抗病基因,根据已知植物抗病基因NBS(Nucleotide binding site)序列中的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA为模板扩增得到4条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistance gene analogues,RGAs)序列,它们核苷酸序列间的相似性系数在53.14%-99.81%之间,而相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在39.08%-99.42%之间。对氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括"P-loop""、Kinase-2a""、Kinase-3a"和"GLPL"4个抗病基因所共有的保守模体,并且4条海南普通野生稻NBS-LRR类似物均属于nonTIR-NBS类抗病基因片段。

海南普通野生稻STK类抗病基因同源序列的分离与分析

根据植物STK抗病基因的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过T/A克隆、测序和序列分析,共获得5条具有连续ORF的STK抗病基因类似物（RGAs）序列,核苷酸序列间的相似性系数为37.82%99.25%,相应氨基酸序列间的相似性系数为31.28%98.86%。氨基酸序列结构分析表明,它们都具有STK保守结构域,与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆海南普通野生稻中的STK类抗病基因提供依据。

棉花NBS抗病基因的发掘

根据已克隆的R基因的保守序列设计引物,在棉花不同抗性品种中克隆出500 bp左右大小片段,克隆测序并在NCBI上进行Blast分析,发现这些序列除一个序列外均与已经克隆的抗病基因类似物(RGAs)同源,且同源性高达98%以上。将这些从棉花中克隆的RGAs和植物中已克隆的几个典型的R基因序列建立进化树,棉花中的RGAs序列分别聚在3个不同的亚家族,可以通过后续的功能验证来确定这些序列片段的功能。

小麦NBS类抗病相关基因片段RGA-A的初步研究

利用同源序列法分离小麦抗病相关基因同源序列。根据已经克隆的抗病基因保守结构NBS区设计引物,采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr24进行扩增。获得了一条525bp条带RGA-A,通过BLASTp比较,序列中含有典型的NBS保守结构域,与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致,编码的蛋白与大麦中抗性蛋白亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,RGA-A受叶锈菌诱导表达,表明该基因在小麦叶片中与抗叶锈性相关。该NBS类抗病基因相关片段的获得为研究小麦抗病基因奠定了基础。

核桃NBS类抗病基因的克隆及序列分析

NBS-LRR蛋白在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。利用RT—PCR技术以香玲核桃叶片为试材，克隆核桃核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）类抗病基因类似物（resistance gene analog，RGA），并对该基因和编码蛋白序列进行分析。结果表明，该序列长512bp，

香蕉抗病种质NBS类RGAs的克隆及相关序列差异分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料GCTCV-119的基因组DNA及cDNA中扩增获得9个DNA片段和10条cDNA片段,均编码为通读的氨基酸序列,命名为"BR-1"-"BR-19",GenBank登录号依次为EF515833-EF515836, EU123871-EU123885。同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop(Kinase-1a)、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因。其中,BR-5和BR-6与番茄抗镰刀菌枯萎病番茄专化型I2、I2-1和I2-2基因聚为一类,可能与香蕉镰刀菌枯萎病的抗性相关。

利用Mlo蛋白质保守域MJ4-MrcD2区扩增小麦抗白粉病基因

利用Mlo蛋白质保守域设计兼并引物,以24个抗性不同的小麦品种为试验材料,采用抗病基因类似物(RGA)法探索小麦白粉病抗病基因快速有效筛选及利用的新方法。结果表明,所用的小麦抗病材料基因组DNA与兼并引物同源区的序列变化较感病材料大,导致扩增效率较低;兼并引物在抗病及感病材料中扩增结果类似,仅从这一结果无法判断扩增出的RGA与小麦白粉病基因间的关系,需要通过下游转化、克隆、测序来进一步筛选抗病相关RGA。