人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。

中国鲎鲎素T-1抗人早幼粒白血病HL-60细胞活性研究

利用从中国鲎血细胞中提取的鲎素Ｔ－１作抗肿瘤活性实验．结果表明，鲎素Ｔ－１在体外对人早幼粒白血病ＨＬ－６０细胞的增殖有明显抑制作用．急性毒理实验显示，鲎素Ｔ－１对正常活体毒性较小，可用于活体实验．荷瘤裸鼠实验统计，鲎素Ｔ－１对肿瘤抑制率达４２．３％．

rIL-2激活的骨髓细胞抗瘤活性——白血病自体骨髓移植净化

用rIL-2激活未分离的骨髓外胞(bone marrow cell,BMC)观察其抗瘤活性和造血功能。经rIL-2激活24h后的未分离BMC即表现对NK细胞敏感的K562和NK细胞不敏感的Raji细胞均有杀伤活性;在一定时间内,随激活时间延长抗瘤活性增强,在第4天达高峰。rIL-2激活的未分离BMC与分离BMC二者抗瘤活性无差异。5例急性非淋巴细胞白血病病人骨髓经rIL-2激活后,白血病祖细胞CFU-L生成能力下降;经rIL-2激活的骨髓细胞生成CFU-GM能力无下降。根据我们的研究结果提出,rIL-2激活未分离BMC可用于白血病ABMT中残留白血病细胞净化,其方法简便、实用。

抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响

目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P<0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%。经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降。

抗氧化剂An7845对K562白血病细胞的增殖抑制和凋亡诱导活性

目的 :观察抗氧化剂An784 5在体外对K5 6 2白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法 :采用液体培养实验 ,MTT实验 ,集落培养实验观察抗氧化剂An784 5对K5 6 2细胞增殖的影响 ,采用细胞形态学及DNA片段凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果 :不同浓度的An784 5 (5× 10 8～ 5× 10 5mol/L)对K5 6 2细胞具有抑制增殖的作用 ,并呈剂量依赖关系。经An784 5 (5× 10 7mol/L)处理后 ,K5 6 2细胞在形态学上可见明显凋亡细胞 ,DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见DNA梯形带。结论 :抗氧化剂An784 5能抑制K5 6 2白血病细胞增殖和诱导其凋亡。

色酮吡唑啉酮类衍生物的合成及抗白血病细胞活性

以色酮-吡唑啉酮作为C1合成子,在5 mol%的DBU催化下,与α,β-不饱和酮发生Michael加成反应,获得了10个色酮吡唑啉酮类衍生物3a~3j,产率76%~90%,dr值为4/1~9/1,其结构经^(1)H NMR,^(13)C NMR和HR-MS(ESI-TOF)表征,通过单晶进一步进行了确定化合物3b的相对构型。该类化合物包含有连续两个立体中心,包括一个季碳中心,可以为生物活性筛选提供物质基础。采用MTT法研究了3a~3f对人白血病细胞(K562)的体外抗增殖活性。结果表明:化合物3a,3c,3d和3i对K562增殖具有一定的抑制活性。

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105U·ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104U·ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.

碳源对迷迭香悬浮培养细胞的生长、迷迭香酸积累及抗氧化酶活性的影响

以迷迭香悬浮培养细胞为材料,详细研究了基本培养基中添加蔗糖、麦芽糖和葡萄糖对细胞生长及次生代谢产物积累的影响,同时对不同蔗糖浓度处理的悬浮培养细胞抗氧化酶活性进行了研究。研究结果表明:在不同的糖处理中,30 g·L-1的蔗糖、70 g·L-1的麦芽糖及40 g·L-1的葡萄糖最有利于迷迭香悬浮培养细胞生长。30 g·L-1蔗糖和70 g·L-1麦芽糖处理中悬浮培养细胞的生长率分别为74.08%和72.33%,高出40 g·L-1葡萄糖处理接近3倍之多。30 g·L-1蔗糖处理的悬浮培养细胞迷迭香酸含量高出70 g·L-1麦芽糖处理228倍,略低于40 g·L-1葡萄糖处理。在不同蔗糖的处理中,随着蔗糖浓度的增加,迷迭香酸含量均呈现增加趋势,表明高浓度的蔗糖有利于悬浮培养细胞迷迭香酸的积累。在高浓度的蔗糖处理中,悬浮培养细胞H2O2和MDA含量明显增加,同时抗氧化酶SOD、POD及CAT的活性也明显增强,表明高浓度的蔗糖产生了渗透胁迫,这种渗透胁迫虽不利于迷迭香悬浮培养细胞的生长,但有利于次生代谢产物的积累。综合迷迭香悬浮细胞的生长率和迷迭香酸的含量,我们最终得出30 g·L-1的蔗糖最有利于迷迭香悬浮细胞的培养。

姜黄素体外抗人巨细胞病毒活性的研究

目的研究姜黄素体外抗人巨细胞病毒(HCMV)的作用和安全性。方法以更昔洛韦为对照药物,采用细胞病变效应(Cytopathologic effects,CPE)和四甲基偶氮唑盐(MTT)法评价姜黄素体外抗HCMV AD169活性。结果更昔洛韦和姜黄素的最大无毒浓度(TC)0分别为50.00,6.44μg/mL;最小有效浓度分别为8.90,0.12μg/mL;治疗指数分别为16.57和102.42。结论姜黄素在体外具有显著的抗人巨细胞病毒的活性。

自然杀伤细胞的抗病毒活性

自然杀伤细胞是一类不同于T、B淋巴细胞的多功能淋巴细胞 ,在抗病毒免疫中发挥着重要作用。目前关于自然杀伤细胞参与抗病毒反应的研究主要集中于以下 3点 :①自然杀伤细胞介导抗病毒反应的路径 ;②自然杀伤细胞受体的功能 ;③自然杀伤细胞及自然杀伤T细胞在抗病毒反应中的激活和作用机理。尽管其中仍然存在许多悬而未决的问题 。

靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究

为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36 h时,对细胞中FMDV VP1基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。

利用小鼠脾细胞上清抗病毒活性建立新型抑制性ODN的体外筛选方法

目的：通过检测小鼠脾细胞上清抗病毒活性,建立一种体外筛选小鼠敏感的新型抑制性寡聚脱氧核苷酸（ODN）的方法,为后续小鼠体内实验提供抑制性ODN的体外筛选方法。方法：将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组,收集不同浓度（0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00及32.00 mg.L-1）的CpG 2216刺激上清及CpG 2216作用小鼠脾细胞不同时间（3、6、12、24、48、72及96 h）的刺激上清,通过VSV病毒保护实验检测的A578评价各组上清的抗病毒活性,确定CpG 2216的最佳作用浓度、作用时间及刺激上清稀释度;再将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216＋抑制性ODN（A151）组,同上确定A151的最佳作用浓度;将小鼠脾细胞分为对照组、CpG 2216刺激组、CpG 2216＋抑制性ODN（MAT0106）组,应用上述优化的实验条件如各ODN剂量、作用时间等处理细胞后,收集刺激上清,采用VSV病毒保护实验,观察各抑制性ODN的抑制作用,以初步判定此方法的可行性。结果：筛选方法确定为：浓度为5×10^6·mL^-1的小鼠脾细胞铺于96孔圆底细胞培养板,加入CpG 2216至终浓度2 mg·L^-1和/或抑制性ODN至终浓度16 mg·L^-1,孵箱中培养24 h后收集上清,1∶4稀释上清后加入已贴壁的L929细胞板内,共孵育18 h后弃上清,加入VSV病毒液继续培养48 h。弃净上清后结晶紫染色、脱色并检测A578。此种筛选方法可以区别本室自行设计的抑制性ODN之间的抑制活性。结论：成功建立了抑制性ODN抑制小鼠脾细胞抗病毒活性的筛选方法,抑制性ODN的小鼠体外筛选方法的建立,为后续抑制性ODN在小鼠体内的生物学活性观察提供了体外筛选平台。

慢病毒介导抗菌肽PR-39基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达及抗菌活性检测

目的构建脯氨酸精氨酸抗菌肽（proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39）慢病毒载体,并转染兔骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSC）,检测其在BMSC中的表达及抗菌活性。方法PCR扩增目的克隆,并连接入慢病毒载体质粒pGC-FU中,与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0在脂质体2000介导下共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,Real-TimePCR法检测其滴度;分离培养BMSC,BMSC转染PR-39慢病毒,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测其转染效率,RT-PCR检测PR-39基因表达,并检测PR-39抗菌活性。结果成功包装出滴度为2×10~9 TU/mL的PR-39慢病毒载体,并转染BMSC,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为74.09%,同时RT-PCR检测BMSC表达PR-39基因,其上清液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌率为98.43%（P〈0.05）。结论在慢病毒介导下,BMSC成功表达分泌具有较强抗菌活性的抗菌肽PR-39。

内源性低分子生物活性因子(ILAF)抗实验性白血病机制初探

内源性低分子生物活性因子(ILAF)是一种经过同种异体动物对肿瘤细胞抗独特型(idiotype)抗体的免疫应答过程，在动物体内诱发产生的抗植入性同种系肿瘤细胞的低分子肽。ILAF在正常机体内也有少量存在。这种内源性低分子生物活性因子对肿瘤细胞有很强的抑制和杀伤作用。从而使接种肿瘤细胞株动物的生存期显著延长。

植物细胞分裂素ortho-Topolin Riboside对人白血病细胞株THP-1的抗癌活性及机制初探

本研究以人急性髓性白血病细胞株THP-1为研究对象,初步探讨其抗癌活性及作用机制。通过光学显微镜观察N6-2-苄胺羟基腺苷(oTR)作用后THP-1细胞形态学和数目变化;CCK-8法检测oTR对THP-1细胞的增殖抑制作用,并用核苷转运体拮抗剂和腺苷受体拮抗剂预处理细胞检测oTR进入细胞的方式;用流式细胞仪分析oTR作用对THP-1细胞凋亡和分化的影响。结果表明,oTR可显著(P<0.05)抑制THP-1细胞的增殖能力,且呈浓度依赖性;核苷转运体拮抗剂Dipyridamole预处理THP-1细胞后,可明显逆转oTR的增殖抑制作用,而4种腺苷受体拮抗剂(DPCPX、SCH58261、MRS1754和MRA1191)则无显著影响;oTR可诱导处理组细胞亚倍体峰比例显著(P<0.05)高于对照组,且细胞髓系分化标志蛋白CD11b表达明显升高。以上结果表明细胞分裂素oTR通过核苷转运体途径进入THP-1细胞,显著(P<0.05)抑制细胞的增殖,并可诱导THP-1细胞发生凋亡和髓系分化。

朱砂七化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性研究

目的研究朱砂七Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性。方法朱砂七75%乙醇提取物采用硅胶柱层析、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT法测定体外细胞毒活性,CCK-8法测定体外抗病毒活性。结果从中分离得到20个化合物,分别鉴定为3-acetyl-4,5-dimethoxy-benzoic acid(1)、没食子酸甲酯(2)、没食子酸(3)、对羟基苯甲醛(4)、原儿茶酸(5)、3,4-二羟基苯甲醛(6)、丁香酸(7)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(8)、p-hydroxyphenethyl-O-β-D-glucoside(9)、2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethyl-O-β-D-glucoside(10)、反式-白藜芦醇(11)、顺式-白藜芦醇(12)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-反式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(13)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-顺式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(14)、白藜芦醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(15)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(16)、poke-weed cerebroside(17)、何首乌乙素(18)、9,10,13-三羟基十八烷酸(19)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(20)。化合物11对HCT116、SW620细胞的IC 50值分别为(30.87±2.7)、(56.11±0.49)μmol/L,化合物12对EV-A71病毒的抑制率为50.21%。结论化合物1为新天然产物,化合物9~10为首次从蓼科植物中分离得到,化合物8、12、14、17、19为首次从何首乌属植物中分离得到,化合物2、4~7、11、18为首次从该植物中分离得到。化合物11具有细胞毒性,化合物12具有抗病毒活性。

MDCK细胞ISG15基因的克隆表达及抗病毒活性分析

为了解ISG15基因体外抗病毒机制,应用RT-PCR方法扩增了MDCK细胞的ISG15基因,经测序分析,该基因序列与Gen Bank中登录的犬属ISG15基因序列相似性为99%。将该基因亚克隆至p ET-28a载体构建出重组原核表达质粒p28a-M15;工程菌p28a-M15/BL21经IPTG诱导表达,获得了约22 k D的重组目的蛋白,重组蛋白经Ni2+柱层析纯化。于H9N2亚型禽流感病毒S2株感染前后在MDCK细胞中定量加入纯化的ISG15蛋白,结果显示,病毒感染MDCK细胞前加入ISG15蛋白可以抑制病毒的复制,但病毒感染后添加该蛋白则促进了病毒的复制。

Envision法免疫组织化学染色研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子的抗肿瘤活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子(vascular endothelial growth inhibitor，VEGI)的抗肿瘤活性及其机制。方法：用重组人可溶性VEGI治疗荷S180肉瘤小鼠；第VIII因子相关抗原(FVIII RAg)标记肿瘤血管内皮细胞，用免疫组化Envision法检测瘤内微血管密度。结果：重组人可溶性VEGI显著抑制S180肉瘤生长，肿瘤微血管密度大大减低。结论：VEGI具有较强的抗肿瘤活性，其机制可能是通过抗新生血管形成介导的。

金莲花汤不同提取物对细胞增殖的影响及体外抗病毒活性研究

目的 探讨不同提取方法的金莲花汤提取物(金莲花汤不同提取物)对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖以及对小鼠H1N1流感病毒活性的影响方法 通过MTT法观察药物处理后对小鼠巨噬细胞Raw264.7生长增殖情况的影响;利用小鼠H1N1流感病毒感染MDCK细胞,进行病毒扩增并测定病毒效价;利用小鼠H1N1流感病毒感染小鼠巨噬细胞Raw264.7,采用MTT法结合CPE方法确定金莲花汤不同提取物的抗病毒效果。结果 MTT结果发现,金莲花汤不同提取物(20%、40%、60%、80%、95%、二次80%、二次95%及粗提取物)均对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖具有明显的抑制作用,IC_(50)分别为0.063、0.064、0.145、0.065、0.064、0.064、0.105、0.2mg/ml;MTT结果结合CPE分析显示,60%金莲花汤提取物IC_(25)及IC_(50)的药物剂量有轻微的抗病毒效果;80%金莲花汤提取物IC_0及二次95%金莲花汤提取物IC_(25)的药物剂量抗病毒效果较好,差异有统计学意义。结论不同提取方法的金莲花汤提取物对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖有一定的抑制作用;在体外抗病毒实验中,一定提取纯度的金莲花汤提取物对小鼠H1N1流感病毒有抑制作用。