基于寨卡病毒复制子的抗病毒药物筛选系统

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是引起成人格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)以及胎儿和新生儿小头畸形疾病的重要病原体。有效的抗病毒药物筛选系统是防治ZIKV感染的有效工具。本研究构建了以海肾荧光素酶为检测靶标的寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep,并通过突变NS5蛋白,构建了非复制型寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep NS5△GDD。为了检测复制子的功能,将两种复制子转化至Vero细胞,结果显示随着时间延长,Rluc-ZIKV-Rep荧光素酶活性逐渐增加,寨卡病毒mRNA拷贝数逐渐增多,证明以海肾荧光素酶为检测靶标的寨卡病毒复制子构建成功。为了检测该系统是否能够用于抗病毒药物筛选,用马尼地平和西尼地平两种抗寨卡病毒的药物进行检测,结果显示Rluc-ZIKV-Rep的复制能力随着药物浓度的增加而逐渐降低,呈现一种剂量依赖的方式,说明该系统可以用于抗病毒药物的筛选。综上所述,本研究构建了一种可以用于抗病毒药物筛选的寨卡病毒复制子,为筛选有效的抗病毒药物提供了有力工具。

基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法,实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料,构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒,利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响,并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示,Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点,并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示,水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示,6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上,本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒,可用于抗水生病毒药物的筛选,也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。

基于荧光素酶的抗巨细胞病毒体外药物筛选模型的建立及应用

人巨细胞病毒(HCMV)感染是常见的病毒性疾病,目前无有效的疫苗,故抗病毒药物筛选对HCMV的治疗具有重要意义。为了构建一种抗巨细胞病毒体外药物快速筛选模型,本研究以带有荧光素酶标签的鼠巨细胞病毒细菌人工染色体(Luc-MCMV-BAC)为基础,将其转染至小鼠成纤维细胞NIH-3T3,成功获得重组病毒Luc-MCMV,且其能够在细胞中稳定发光。噬斑法测定的病毒生长曲线显示,Luc-MCMV与野生型病毒Wt-MCMV具有相似的生长动力学,说明Luc-MCMV能够反映Wt-MCMV的生长状况,可用于后续抗病毒药物的筛选评价。进一步选用更昔洛韦(Ganciclovir)作为阳性对照药物,应用该体系对6种中药单体进行了筛选,结果显示黄芩素和黄芪甲苷具有抗MCMV活性,为抗HCMV药物的筛选奠定了前期基础。

表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用

塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。

用离体兔气管平滑肌建立抗鼻病毒药物的药效学评价模型

人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)是引起病毒性呼吸道感染的最常见病原体,目前尚无有效治疗药物。由于HRVs绝大多数血清型仅对灵长类动物易感,对常用实验动物不感染,目前多在细胞水平对抗HRVs药物进行筛选与评价,这对抗HRVs药物的有效性研究明显不足。本文根据HRVs对呼吸道感染的特点,以离体气管平滑肌(ASM)收缩反应变化为评价指标,建立了可模拟呼吸症状的筛选模型,在此模型上接种鼻病毒后ASM对于激动剂引发的收缩反应显著增强150%,舒张反应明显减弱至63%,而预先加入已经过细胞初筛有效的化合物后,可显著改善鼻病毒引发的收缩反应异常,表明所建立的评价模型可用于抗鼻病毒药物的进一步筛选。

高通量技术在病毒学研究中的应用

病毒可以引起许多种不同的疾病,如常见的感冒,以及病毒性脑炎、肺炎、肝炎、肾炎、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病、艾滋病等疾病,也是老年性痴呆以及许多癌症（如宫颈癌等）的重要致病因子.近年更有SARS冠状病毒、H1N1、H7N9流感病毒等严重威胁公众健康的新型病毒出现[1].