肠道病毒-D68 2A蛋白对抗病毒IFN-Ⅰ通路影响的研究

目的观察肠道病毒(EV)-D68蛋白2A在EV-D68病毒感染293T细胞过程中对抗病毒IFN-Ⅰ通路的影响。方法免疫印迹法(Western blot)检测重组2A蛋白、IFN-α因子及信号传导及转录激活因子1(STAT1)的蛋白表达水平;免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测细胞内不同时间点EV-D68病毒VP1与2A的表达;通过观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),计算细胞培养半数感染量(50% cell culture infective dose,CCID50)来检测病毒感染性滴度;利用实时荧光定量PCR技术(real-time PCR,RT-PCR)检测IFN-Ⅰ干扰素产生相关基因的表达。结果成功构建pCLIPf-2A质粒,在转染后的24 h,重组蛋白2A有较好的表达。病毒滴度结果表明,2A蛋白在感染后期可以有效促进EV-D68病毒的增殖复制。IFN-α干扰素检测结果表明,EV-D68 2A可以刺激IFN-α的表达。IFN-Ⅰ干扰素相关基因检测表明,EV-D68+2A组、2A组及EV-D68对照组的IFN-Ⅰ干扰素产生相关基因的IFN-α mRNA水平均有不同程度的上调或下调,但是三者诱导相关基因表达上调、下调的趋势不同。对IFN-Ⅰ干扰素通路下游蛋白STAT1检测结果表明,各组均能有效诱导STAT1蛋白的表达。结论EV-D68 2A可以促进抗病毒IFN-Ⅰ通路相关基因及下游蛋白的应答,病毒感染后期,2A可以促进病毒较快增殖。

ZWINT在RLR抗病毒先天免疫信号通路中的作用

目的探究ZWINT(ZW10 interacting kinetochore protein)对TBK1(TANK-binding kinase 1)或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的RLR(RIG-I like receptor)抗病毒先天免疫信号通路的影响。方法应用免疫共沉淀的方法检测ZWINT与RLR信号通路分子TBK1、VISA、RIG-I之间的相互作用;用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证ZWINT对TBK1或SeV诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测TBK1或SeV介导下ZWINT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测ZWINT对SeV诱导的IFN-β转录的影响。结果 ZWINT与TBK1、VISA和RIG-I都有相互作用,过表达ZWINT增强了TBK1或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性,此外,过表达ZWINT也加强了SeV诱导的IFN-β的转录。结论ZWINT是RLR抗病毒先天免疫信号通路中的正调控因子。

清肺解毒颗粒调控Ⅰ型干扰素通路抗RSV效应的机制研究

目的:基于Ⅰ型干扰素通路探究清肺解毒颗粒(QJG)发挥抗呼吸道合胞病毒(RSV)的效应机制。方法:将40只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组(Con组),模型组(RSV组),RSV+清肺解毒颗粒组(RSV+QJG组),RSV+IFN-α阻滞剂组(RSV+IFN-α Inh组),RSV+IFN-α阻滞剂+清肺解毒颗粒组(RSV+IFN-α Inh+QJG组)。除Con组外,其余各组小鼠给予RSV毒株,其中RSV+IFN-α Inh组、RSV+IFN-α Inh+QJG组在两次滴鼻造模前分别给予IFN-α阻滞剂。在感染后治疗组采用QJG给药治疗。观察各组小鼠的一般状态,并在治疗3 d后处死取材。HE染色法观察肺组织的病理改变并评分,ELISA方法检测小鼠血清中IFN-α/β的水平,Q-PCR检测小鼠肺组织RIG-Ⅰ、MAVS、RSV-F、RSV-G等基因的转录水平,免疫荧光、Western Blot检测RSV-F、IRF3、OAS1、MX1等蛋白表达水平。结果:与RSV组比较,QJG药物治疗能够显著抑制肺组织RSV水平,同时改善肺组织炎性损伤(P<0.01)。与RSV组比较,RSV+QJG组小鼠肺组织中RIG-Ⅰ、MAVS、p-IRF3、IFN-α/β、OAS1、MX1等基因的表达水平显著升高(P<0.01,P<0.05)。IFN-α阻滞剂的干预能够影响QJG的抗病毒效应及IFN-α、OAS1、MX1升高水平(P<0.01,P<0.05)。结论:QJG可能通过调控Ⅰ型干扰素通路从而发挥抗RSV的效应。

卵巢癌结构域蛋白酶-1基因拮抗IFN-α抗病毒效应研究

目的研究卵巢癌结构域蛋白酶-1(ovarian tumor domain-containing protease-1,OTUD1)基因对Ⅰ型干扰素信号通路的影响以及对IFN-α抗病毒效应的影响。方法双荧光素酶报告试验检测OTUD1基因对IFN-α诱导的干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)启动子转录活性的影响;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测OTUD1对IFN-α诱导的干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)表达水平的影响;Western blot检测OTUD1对干扰素信号通路关键分子表达的调控作用,qPCR和ELISA检测其对IFN-α抑制乙型肝炎病毒复制的影响。结果在HEK293T和Huh7.0细胞中,OTUD1下调了干扰素信号通路下游的ISRE启动子转录活性以及ISG15和ISG56等抗病毒基因的表达。在HEK293T细胞中,OTUD1降低了磷酸化蛋白质酪氨酸激酶(phospho-Jak1,p-JAK1)的蛋白质表达水平,但是OTUD1酶活突变体C320S不能调控ISGs和p-JAK1的表达。在Huh7.0细胞中,OTUD1降低了IFN-α抑制乙型肝炎病毒复制的效应。结论OTUD1通过其泛素化酶活性下调p-JAK1的蛋白质表达水平,抑制干扰素JAK-STAT信号通路及ISGs表达。OTUD1拮抗IFN-α抑制病毒复制的效应可能与干扰素诱导的JAK-STAT信号通路有关。

慢性乙型肝炎患者IFN-α/β受体和细胞因子表达与干扰素疗效间的关系

目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者α干扰素治疗前后血清中细胞因子及受体水平及治疗前外周血单个核细胞(PBMCs)中Ⅰ型干扰素受体,并观察α干扰素疗效,以探讨α干扰素与病毒复制消长的关系。方法:采用酶标(ELISA)法检测22例CHB患者治疗前后血清中细胞因子及受体(IL6,IL2,TNFα,IL8,sIL2R)水平,并用链霉亲和素生物素酶复合物法(SABC)检测α干扰素治疗前患者PBMCs中IFNα/β受体表达。结果:治疗应答者血清IL6,sIL2R水平下降明显,而IL2水平则明显上升。22例CHB患者中,干扰素治疗完全应答者7例,其中IFNα/β受体高表达者6例,占85.71%;干扰素治疗无应答者11者,其中IFNα/β受体高表达者3例,占27.27%。两者间比较差异有显著性意义(P<0.05)。部分应答者4例,IFNα/β受体高表达者2例。结论:干扰素治疗CHB患者其疗效与细胞膜上IFNα/β受体表达水平和血清细胞因子的调节密切相关。应重视对IFNα/β受体及血清中细胞因子及受体水平的监测,以提高α干扰素抗乙肝病毒的疗效。

RIG-Ⅰ在抗病毒固有免疫中的功能和机制研究进展

RIG-Ⅰ是维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族(Retinoic-acid-inducible geneⅠ-like receptors,RLRs)的成员之一,在抗病毒固有免疫应答中发挥重要作用。作为细胞质中的一种RNA解旋酶,RIG-Ⅰ可通过其RNA结合结构域与PAMPs结合,识别非自身病毒RNA,触发自身以及下游信号分子的活化,最终诱导IFN-Ⅰ、炎性细胞因子、趋化因子等产生,激活抗病毒免疫应答。本文综述了RIG-Ⅰ在抗病毒识别中的结构特性及在多种RNA病毒与DNA病毒感染中的抗病毒免疫作用或病毒免疫逃逸作用的研究进展,以期为深入研究RIG-Ⅰ抗病毒免疫调控机制及病毒免疫逃逸机制,进而为发现新的抗病毒靶点、研制新型抗病毒药物和疫苗提供理论参考。

北豆根总生物碱的抗病毒感染功能与机制

目的:探讨北豆根总生物碱的抗病毒感染作用及其与Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路的关系。方法:通过倒置荧光显微镜、流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)等方法检测北豆根总生物碱对甲型流感病毒(H1N1)、水疱性口炎病毒(VSV)和脑心肌炎病毒(EMCV)在细胞内复制的影响。构建H1N1病毒感染小鼠模型,将小鼠分为空白组、H1N1模型组、北豆根总生物碱组(10、20、30 mg·kg^(-1))和奥司他韦组(40 mg·kg^(-1)),研究北豆根总生物碱对感染小鼠的体质量和生存率的影响。Real-time PCR检测北豆根总生物碱对细胞中IFN-Ⅰ通路的激活作用,并在干扰素受体1(IFNAR1)敲除的A549细胞(IFNAR1^(-/-)-A549)检测北豆根总生物碱抗病毒感染作用与IFN-Ⅰ通路的关系。结果:与空白组比较,病毒感染模型组中的病毒大量增殖(P<0.01);与模型组比较,北豆根总生物碱在体外显著抑制H1N1、VSV和EMCV的复制(P<0.01),在体内抑制H1N1病毒感染小鼠体质量降低,提升小鼠生存率(P<0.05)。此外,北豆根总生物碱激活IFN-Ⅰ通路并依赖该通路发挥抗病毒感染作用。结论:北豆根总生物碱通过激活IFN-Ⅰ通路发挥体内和体外的抗病毒感染作用。

5⁃羟色胺调控抗病毒先天免疫的作用及机制探究

目的探究经典神经递质5⁃羟色胺(5⁃HT)对抗DNA病毒先天免疫的影响与作用机制。方法使用5⁃HT ELISA试剂盒检测1型单纯疱疹病毒(HSV⁃1)感染后小鼠血液中5⁃HT含量变化;在细胞水平使用5⁃HT或5⁃HT转运体抑制剂预处理后进行外源DNA转染或HSV⁃1感染,Western印迹在蛋白质水平检测胞内cGAS⁃STING通路激活情况,实时定量PCR在mRNA水平检测Ⅰ型干扰素及病毒复制水平。体内使用5⁃HT给药后进行HSV⁃1感染,收集血样采用ELISA试剂盒检测血清Ⅰ型干扰素水平,实时定量PCR检测器官中病毒复制量。结果HSV⁃1病毒感染小鼠后,小鼠血液内5⁃HT含量显著上调,在机体或细胞水平给予5⁃HT预处理均会抑制HSV⁃1病毒介导的Ⅰ型干扰素产生,同时病毒复制增强;机制研究发现5⁃HT可能通过5⁃HT转运体进入胞内发挥作用,抑制cGAS⁃STING通路关键蛋白磷酸化,进而抑制下游Ⅰ型干扰素基因的表达,从而影响宿主的抗病毒天然免疫能力。结论5⁃HT可抑制机体cGAS⁃STING通路介导的抗DNA病毒先天免疫,有望为抗病毒药物研发找到新的靶点。

鱼类干扰素系统基因研究进展

干扰素是一类多基因家族诱导性细胞因子,可在脊椎动物细胞中诱导建立抗病毒状态,并在抗病毒防御中起重要作用。干扰素系统包括应答外界刺激(如病毒感染)而合成干扰素的细胞,和应答干扰素建立抗病毒状态的细胞。干扰素系统基因主要包括Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素、干扰素刺激基因以及组成干扰素信号传导系统的基因。鱼类干扰素类作用发现较早,而对其基因的克隆和鉴定较晚。随着哺乳类和鸟类中干扰素及其相关基因研究的开展和深入,近年来鱼类干扰素及其相关基因的研究也得到快速发展。综述了鱼类干扰素系统基因的克隆、鉴定,以及其功能方面的研究进展。

SFTSV介导的固有免疫应答及其通过抑制宿主蛋白泛素化修饰实现免疫逃逸的调控机制

发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)感染可造成发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)。SFTS重症患者大多与SFTSV引起非正常的固有固有免疫反应所导致的细胞因子风暴有关。这些早期固有固有免疫反应包括多种炎症和抗病毒基因的表达,并激活随后的固有固有免疫反应和适应性免疫。感染细胞的早期固有固有免疫反应是由模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)、接头蛋白、激酶和转录因子组成的细胞内信号通路所介导的。这些途径受复杂的翻译后修饰网络的严格调节,其中大量的泛素化酶和去泛素化酶使这些修饰可逆且高度动态。这些酶的调控作用可以增强固有免疫反应以抵抗病原体的入侵,也可以抑制其过度活化以避免病理性免疫反应。本文综述了SFTSV引起的早期固有免疫信号通路及其复杂调控机制,为后续针对SFTSV的药物开发和免疫病理学提供了基础。

Ⅲ型干扰素最新研究进展

IFN-λ是新发现的分类为Ⅲ型干扰素的细胞因子,由IFN-λ1,IFN-λ2和IFN-λ3组成,也称作IL29,IL28A和IL28B.IFN-λ通过与其受体复合物结合进行信号转导,该复合物由特异性的IFN-λR1以及与IL-10相关的细胞因子共有的受体IL-10R2组成.IFN-λ主要激活Jak-STAT通路诱导抗病毒、抗增殖、抗癌以及先天或适应性免疫反应.其晶体结构与IL-10细胞因子家族相似.诱导IFN-λ基因表达的通路尚未被研究透彻,在一定程度上同IFN-α类似,涉及TRIF,RIG-I或IRF7通路.IL28B的核苷酸多态性与丙型肝炎病毒(HCV)的自发性清除及HCV联合疗法的结果有关联,预示IFN-λ可以作为替代目前IFN-α治疗HCV感染的一个更有效的选择.本文提供了IFN-λ的一些研究进展,关于IFN-λ的很多机制目前仍是未知的.