转多个抗真菌蛋白基因水稻植株的获得及其抗稻瘟病菌的初步研究

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、苜蓿葡聚糖酶（βＧｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ）基因和潮霉素（ｈｐｔ）基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中，获得了７个潮霉素抗性再生系，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明２～３个抗真菌蛋白基因已整合到水稻基因组中．

天麻抗真菌蛋白(GAFP)的N端序列测定及cDNA基因克隆

从新鲜天麻次生块茎中将天麻抗真菌蛋白(GAFP)提纯,然后测得其N端的30个氨基酸,根据氨基酸序列设计了一段30bp的核酸探针,从cDNA文库中筛选到了编码该蛋白的基因,为这一新型蛋白在抗真菌基因工程中的应用奠定了基础。

天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白 (gastrodiaantifungalprotein简称GAFP)是从我国传统中药天麻 (GastrodiaelataBl.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质 ,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用 ,因此 ,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法 ,将GAFP的基因gafp转入 3个新疆彩色棉品种中 ,通过田间抗病筛选和分子检测 ,得到了高抗黄萎病的转基因植株 ,两株Southern杂交阳性植株LB_5_8和ZB_1_49对黄萎病表现整株免疫。RT_PCR的结果显示 ,LB_5_8和ZB_1_49中均有gafp的正确转录 ;离体的抑菌实验也表明 ,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制 ,表明了gafp在转基因植株中的正确表达 ,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁 ,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力 ,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。

转天麻抗真菌蛋白基因提高棉花对黄萎病抗性

黄萎病是全球植棉业的主要病害,严重缺乏抗黄萎病资源导致棉花抗黄萎病育种至今未取得显著进展。采用农杆菌介导法,以下胚轴为受体,将天麻抗真菌蛋白基因转化陆地棉品系苏研060,通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和植株再生,获得大量再生苗。分别以NPT II基因、gafp基因、35S启动子-gafp基因特异引物对再生苗进行PCR检测,将95个阳性再生苗嫁接到海7124幼苗砧木上,获得37个成活植株。RT-PCR检测发现,31个植株出现预期的540 bp扩增片段。盆栽花铃期花粉育性鉴定表明,9个转基因植株雄性败育,22个植株花粉育性正常,通过人工自交得到T1代种子。通过转基因作物隔离区种植、特异引物PCR检测、卡那霉素抗性筛选、自交纯合与选择,培育获得22个T3代转基因纯系。Southern blotting检测发现,转基因植株体内有2个gafp基因拷贝。GAFP蛋白免疫印迹表明,16个转基因纯系出现分子量为14 k D的GAFP蛋白,另6个纯系表现出转录后水平上的基因沉默。黄萎病抗性鉴定结果证实,获得3个抗落叶型黄萎病的棉花株系TG09、TG16和TG23。

杜仲皮中抗真菌蛋白的分离和特性研究

从杜仲（ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ）皮中分离纯化到一种新的抗真菌蛋白（ＥｕｃｏｍｍｉａＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＰｒｏｔｅｉｎ），简称ＥＡＦＰ。将切碎的杜仲树皮用ＮａＣｌ溶液在组织捣碎器中高速匀浆提取，经硫酸铁沉淀、ＣＭ一ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ离子交换层析和Ｂｉｏ一ｇｅｌ一ｐ一１０凝胶层析纯化。如此纯化而得的ＥＡＦＰ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶片上显示一条分子量为５．０ｋＤ的单一带。反相ＨＰＬＣ显示４样品是纯的。等电聚焦电泳测得其ｐＩ值大于１１．０。经还原和氨酰羧甲基化处理，用ＨＰＬＣ层析证明ＥＡＦＰ为单链。用酚一硫酸法未测出其含糖。ＥＡＦＰ是简单单链蛋白。氨基酸组成分析结果表明它宫含Ａｒｇ、Ｃｙｓ和Ｇｌｙ，不含Ｍｅｔ，Ｌｙｓ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ和Ｐｈｅ。未经热变性或ＳＤＳ处理的ＥＡＦＰ与考马氏亮蓝试剂不发生显色反应。手工Ｅｄｍａｎ降解法测得Ｎ一端３个氨基酸残基的顺序为Ｇｌｙ一Ａｓｐ一Ａｌａ。用羧肽酶Ａ和Ｂ酶解ＥＡＦＰ测得其Ｃ一末端为Ｖａｌ．０．３ｍｇ／ｍＬ蛋白明显抑制木霉、小麦赤霉菌、烟草黑茎病菌和棉花枯萎病菌菌丝的生长。蛋白在沸水中保温３０ｍｉｎ活性不变。

转天麻抗真菌蛋白GAFP基因烟草的获得及离体抑菌活性检测

通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导,采用叶盘法将天麻(GastrodiaelataBl.)抗真菌蛋白基因GAFP转入烟草(NicotianatabacumL.),PCR和Southern blotting分析证明已将GAFP基因整合进烟草植株。体外抑菌实验表明GAFP转基因的烟草植株对真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)表现出一定的抑菌活性。

一种薏苡抗真菌蛋白的制备及抑菌活性研究

以薏苡(Coix chinensis)种子为实验材料,通过脱脂、水提、Resource S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶排阻层析等步骤纯化得到一种新的抗真菌蛋白,并对其抑菌活性进行初步鉴定。SDS-PAGE分析显示该蛋白的分子质量约为28kD。抑菌活性鉴定表明,该蛋白对链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)3株丝状真菌具有显著的生长抑制活性,并呈现出剂量依赖的特征。本研究建立分离薏苡28kD抗真菌蛋白的方法,制备方法简单易行,所得产品纯度达到95%以上。

抗真菌蛋白研究进展

对几种抗真菌蛋白 :病程相关蛋白、防卫素、核糖体失活蛋白、几丁质连接蛋白、蛋白酶抑制剂等的类型、特征、抗菌菌机理进行了阐述 ,着重讨论了病程相关蛋白和核糖体失活蛋白的最新研究进展 ,并且讨论了抗真菌蛋白在植物真菌病害综合防治中的应用前景。

天麻抗真菌蛋白基因转化彩色棉的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆彩色棉 3个品种 (系 ) ,经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测 。

源于银杏叶片中一个抗真菌蛋白(GAFP-1)的分离、纯化和鉴定

经过 8 0 %饱和度硫酸铵沉淀、几丁质亲和层析和SephadexG 75的凝胶过滤层析 3个步骤 ,从银杏(GinkgoBilobaL )的叶片中纯化获得 1个抗真菌蛋白 ,把它命名为GAFP 1。以SDS PAGE胶为基础进行电泳分析 ,GAFP 1的分子量约为 30kD。氨基酸组分分析显示 ,1mlGAFP 1的甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基较其它氨基酸残基多。抑菌分析表明 :1μg或 2 μg的GAFP 1能够抑制水稻纹枯病菌和棉花炭疽病菌菌丝的生长 ,但对水稻稻瘟病菌和小麦纹枯病菌菌丝的生长没有抑制效果。GAFP 1的N 端 10个氨基酸残基为Asp Pro Gly Cys Asn Val Leu Glu Asp Ile ,以这 10个氨基酸残基为基础进行同源性比较发现 ,它与蛋白质数据库中已知的蛋白质没有同源性 ,表明GAFP 1可能是

杜仲抗真菌蛋白晶体生长的原子力显微成像研究——快速生长与晶面生长速率

杜仲抗真菌蛋白(Eucommiaantifungalprotein,EAFP)的单晶体具有在几小时内就可长大的快速生长特性.用原子力显微成像(atomicforcemicroscope,AFM)技术,原位实时观测了EAFP单斜晶体生长过程中的｛10 0｝表面形貌动态变化,并分别在不同的过饱和度下测量了其生长速率.结果表明,EAFP晶体生长的速率与蛋白质溶液的过饱和度相关,在过饱和度高时(σ =1 78)晶面生长极快;在中等过饱和度(σ =1 5)下,其晶面台阶的生长速率沿b,c方向分别为 12nm/s和 2 4 2nm/s,比溶菌酶生长速率(6～ 7nm/s)快很多;在蛋白质浓度很低的情况下,其生长速率仍与其他蛋白质相当.EAFP晶体快速生长可能与该分子尺寸较小,内部结构紧凑,分子骨架呈刚性和分子表面性质等其固有特性密切相关.沉淀剂浓度对EAFP晶体生长也有影响.过饱和度很低时,提高沉淀剂浓度会干扰晶体生长.

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs AFP1( 2 ) 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达 ,其融合表达产物约 2 2kD ,约占总可溶蛋白的 0 .4 5 % (0 .5 % )。抑菌活性试验表明 :重组Rs AFP1( 2 ) 有抑菌活性 ,其中Rs AFP2 较Rs AFP1抑菌活性强。构建了Rs AFP2 基因的植物表达载体pBIAFP2 。利用农杆菌介导法将pBIAFP2 导入番茄中 ,并诱导出完整的植株 32株。对其中 2 8株进行PCR和PCR SouthernBlot检测 ,其中 17株呈阳性。对经PCR SouthernBlot检测呈阳性的植株进行SouthernBlot检测 ,6株呈阳性。

抗真菌蛋白Rs-AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点，构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点，构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１，挑菌落培养，ＩＰＴＧ诱导，使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达，并用体外抑菌试验检测表达产物的活性，结果表明，各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性，其中，ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．

枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白的分离纯化及其部分性质的研究

拮抗菌（Bacillussubtilis）BS-98菌株在BPY液体培养基中产生的蛋白质经硫酸铵分级盐析、SephsdexG-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析和SephadexG－100柱再层析后，分离纯化得到的抗菌蛋白在电泳中显现出三条带。经初步纯化的抗菌蛋白对热稳定，对蛋白酶部分敏感。抑菌谱测定表明，抗菌蛋白对芦笋茎枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、灰霉菌、立枯丝核菌等病原真菌及黄瓜角斑病菌都具有强烈的抑制作用。

天麻抗真菌蛋白GAFP-Ⅰ的一级结构和cDNA克隆

天麻抗真菌蛋白ＧＡＦＰ－Ⅰ是从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ）顶生球茎分离的１４ｋＤ蛋白，它能强烈抑制腐生真菌菌丝的生长，在天麻限制和防止密环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ）侵染球茎的防卫机制中起重要作用。本文报告ＧＡＦＰ－Ⅰ的一级结构和ｃＤＮＡ克隆的核苷酸序列。首先测得Ｎ－末端７个氨基酸序列为ＳＤＲＬＮＳＧ－用以合成一个简并引物，由天麻营养球茎提取ＲＮＡ，通过３′－ＲＡＣＥ技术扩增到一个６００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥ－Ｔ载体中测定核苷酸序列。根据ｃＤＮＡ核苷酸序列和用羧肽酶Ａ测得ＧＡＦＰ－Ⅰ的Ｃ－末端为－ＡＳＧ，确认该ｃＤＮＡ含有４２９ｂｐ编码区，它编码一条１２９个氨基酸的ＧＡＦＰ－Ｉ和１４个氨基酸的Ｃ－末端扩展肽。同时，分离和纯化ＧＡＦＰ－Ⅰ经过羟胺裂解和α－糜乳胰蛋白酶消化产生的肽段，经自动Ｅｄｍａｎ降解程序测出它们的氨基酸序列。结果表明，由此测出的ＧＡＦＰ－Ⅰ氨基酸序列和由ｃＤＮＡ核苷酸序列推导出的序列９８４％一致。ＧＡＦＰ－Ⅰ由１２９个氨基酸组成，富含Ａｓｎ（１９）、Ｇｌｙ（１４），２９和５２位间有一对双硫键，计算分子量为１３９５８Ｄａ。ＧＡＦＰ－Ⅰ与雪花莲（Ｇａｌａｎ?

水稻中一种抗真菌蛋白的分离与特性分析

从萌发的水稻种子中分离并纯化了一种能抑制多种病原真菌生长的蛋白（简称为ＲＡＦＰＩ），在马铃薯葡糖琼脂培养基上，２０μｇＲＡＦＰＩ可明显抑制木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）菌丝的生长，此蛋白还具有较广的抗真菌菌谱，其分子量为１６．５９ＫＤ，等电点为８．７，组成成分中富含Ｐｒｏ、ＧｌＸ和Ａｓｘ，经测序得到了其Ｎ端２０个氨基酸序列。

广谱抗真菌蛋白转基因水稻秸秆模拟还田对土壤真菌群落结构的影响

为探讨广谱抗真菌蛋白转基因水稻秸秆降解对土壤真菌群落结构的影响,本文在室温条件下进行田间秸秆还田模拟试验,设不添加秸秆（S）、添加转基因水稻‘转品1’秸秆（S-Z1）、添加转基因水稻‘转品8’秸秆（S-Z8）、添加非转基因水稻‘七丝软粘’秸秆（S-CK）4个土壤处理,采用传统的平板计数法和变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis, DGGE）技术,分析广谱抗真菌蛋白转基因水稻秸秆模拟还田过程中土壤可培养真菌数和土壤真菌群落的变化情况。平板计数结果表明,在秸秆降解的第40 d,转基因水稻秸秆处理（S-Z1、S-Z8）与非转基因水稻秸秆处理（S-CK）土壤之间的可培养真菌数差异显著,但秸秆降解中后期（50-90 d）, S-Z1、S-Z8和S-CK之间土壤可培养真菌数的差异均不显著。真菌18S rRNA的PCR-DGGE图谱显示, S-Z1、S-Z8和 S-CK 在秸秆降解过程中没有显著不同的条带出现,仅有个别条带在亮度上存在差异。DGGE 图谱条带多样性分析结果表明,在秸秆降解的个别时间段, S-Z1、S-Z8和S-CK之间在丰富度和Shannon-Wiener多样性指数上存在显著差异,而在秸秆降解的整个过程均匀度指数差异均不显著。对 DGGE 主要条带和差异性条带进行克隆测序后发现,子囊菌占最大比重,其次为担子菌、壶菌,而在转基因和非转基因土壤处理间亮度上存在差异的条带属于子囊菌。以上研究结果表明,广谱抗真菌蛋白转基因水稻秸秆降解对土壤真菌群落结构的影响是短暂的、不持续的。

天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究

为获取辣椒的抗真菌种质资源,运用RT-PCR技术扩增出GAFP的cDNA序列,通过基因工程技术构建植物表达载体pBI121-GAFP,并导入遵椒1号辣椒。转化后再生的植株经PCR检测,初步证实GAFP基因已经整合到辣椒基因组中,得到了GAFP基因转化遵椒1号辣椒植株。

杜仲抗真菌蛋白的时空表达特性

为EAFPs基因的分离奠定基础,同时为EAFPs的产生机制、抗菌机理的研究提供科学依据,通过提取和纯化杜仲抗真菌蛋白对该蛋白在杜仲不同部位(皮、叶、根)和不同生长季节的含量变化进行检测。结果表明:杜仲抗真菌蛋白主要分布在树皮中,根中分布较少,在叶中未检测到,而且该蛋白的分布较稳定,不随生长季节而改变。

南瓜籽中一种抗真菌蛋白的提取及抗菌活性研究

裸仁南瓜籽经破碎,磷酸缓冲液4℃浸提,硫酸铵沉淀,上清液透析,SP-Sepharose FF阳离子交换层析,Sephadex G-75凝胶层析柱,冻干等步骤纯化得到一种新的抗真菌蛋白,命名为Pw-1,并对其抗菌活性进行初步鉴定。SDS-PAGE分析显示Pw-1蛋白的分子质量约为14.8 ku。抗菌活性鉴定表明,该蛋白对黄瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和链格孢霉菌3株真菌具有显著的生长抑制活性,并呈现出剂量依赖的特征,IC50值分别为16.64、20.91和21.22μmol/L。加入胰蛋白酶后Pw-1蛋白的抗菌活性消失,表现出蛋白类物质所具有的对于蛋白酶的敏感性。