抗硬蜱亚单位疫苗用候选抗原蛋白的筛选及免疫原性分析

对已经构建保存的PET-28a-GSTK1、PET-28a-GSTE3、PET-28a-Fe1、PET-28a-Fe2和PET-28a-CPL质粒,利用PCR技术检测目的基因,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测5种重组蛋白(rGSTK1、rGSTE3、rFe1、rFe2和rCPL)的表达,利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化4种重组蛋白(rGSTK1、rFe1、rFe2和rCPL),并使用BCA蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,经Western blot测定4种重组蛋白的反应原性,采用间接Elisa测定多克隆抗体效价以及免疫后抗体消长规律。结果显示,5种目的基因条带正确,并未发生丢失;SDS-PAGE检测发现除rGSTE3外,其余4种蛋白(rGSTK1、rFe1、rFe2和rCPL)均能稳定表达且大小分别为28、25、26、27 kDa,以包涵体形式表达;利用His标签纯化蛋白后测定蛋白浓度,结果显示,以250 mmol/L咪唑进行洗脱时可获得高纯度的目的蛋白,蛋白质量浓度分别为2.633、2.532、2.582和2.506 g/L;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA结果显示,4种重组蛋白(rGSTK1、rFe1、rFe2和rCPL)制备的多克隆抗体效价分别高达1∶819200、1∶819200、1∶1638400和1∶409600,表明4种重组蛋白的免疫原性较好,其中rFe2的免疫原性最好;三免后的21 d 4种重组蛋产生的抗体均达到峰值后逐渐降低,但三免后的63 d抗体水平仍处于较高水平,其中rFe2的抗体水平最高,为1∶819200;rGSTK1次之,为819200。Western blot结果显示,4种重组蛋白均可与其多克隆抗体发生特异性反应;其中rFe2的反应原性最强,rGSTK1次之。本研究以重组蛋白的稳定性、高表达、免疫后抗体水平以及与多克隆抗体反应原性为指标,筛选出rFe2为最佳候选抗原蛋白,另外rGSTK1效果与其相当,也可以考虑2种蛋白联合使用,为后续抗硬蜱疫苗的研发提供试验基础。