抗结核化合物9005B的分离纯化、结构解析及生物活性研究

为研究放线菌9005发酵液中的抗结核活性成分,采用活性追踪的方法,用多种色谱技术进行分离纯化,得到活性化合物9005B。通过理化性质和波谱学数据的分析,确定化合物9005B的结构为放线菌素X2。采用定量微孔板快速显色法(MABA)测定出化合物9005B对结核分枝杆菌H37Rv的M IC为64μg/m l,具有较强的抗结核活性,属首次报道。

新型抗结核化合物体内外活性评价方法的研究进展

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性呼吸道传染病,是全球十大死因之一,也是由单一传染源导致死亡的主要原因,排名高于艾滋病。2019年因TB死亡的人数是120万人[1]。MTB具有特殊的生理特征,包括生长缓慢、自然状态下基因突变率较高以及用药后易形成持留菌株等,导致TB治疗用药周期较长。

抗结核化合物的设计与合成

为解决结核病药物耐药性问题,抗结核化合物修饰的受关注程度不断提升。基于此,本文将围绕抗结核化合物的设计与合成进行研究,基于异烟肼原料开展了9种抗结核化合物的制备,这类抗结核化合物能够抑制半胱氨酸合酶,具备几乎等同于常用药物的药效。

以金色分枝杆菌为模式菌株筛选抗结核活性化合物可行性研究

目的评估以金色分枝杆菌作为结核分枝杆菌模式菌株筛选抗结核抑制剂的可行性。方法以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv建立细胞水平的抑制剂高通量筛选模型,对本单位化合物库部分样品进行筛选,获得具有抗结核活性的化合物;进一步比较模式菌株金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌及谷氨酸棒状杆菌对具有较强抗结核活性样品的敏感性差异。结果利用基于结核分枝杆菌建立的全细胞筛选模型,从本单位化合物库的5万个样品中筛选得到67个最低抑菌浓度≤5μg/ml的化合物。对金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌有抑制活性的样品分别有22个(32.84%)、10个(14.93%)、12个(17.91%)和6个(8.96%),其中抑菌活性与抗结核活性差异在4倍以内的样品分别有16个(72.73%)、5个(50%)、7个(58.33%)和3个(50%)。结论相对于其他3种模式菌株,金色分枝杆菌对本单位样品库化合物的敏感性与结核分枝杆菌的最为接近,以金色分枝杆菌为模式菌株开展抑制剂筛选研究更有可能获得具有抗结核活性的化合物。

一种新型抗结核先导化合物S28对结核分枝杆菌蛋白质组表达的影响

目的探讨从化合物库中高通量筛选得到的、可有效抑制结核分枝杆菌生长和繁殖的新型活性化合物S28的作用机制及其可能的作用靶点。方法采用双向电泳技术,比较分析活性化合物作用于结核分枝杆菌H37Ra前、后的全细胞蛋白表达差异。结果13个蛋白质斑点表达下调,对其中6个改变明显的蛋白质斑点进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析,成功测定2个蛋白质斑点。数据库检索分析确定这2个差异蛋白点分别为延长因子Tu和短链脱氢酶,是参与蛋白质翻译和氧化呼吸、能量代谢等生理过程的重要蛋白。结论为进一步深入探索新型抗结核活性化合物的作用机制和可能的靶点提供研究基础和方向。

抗结核活性化合物HY-152E的作用靶点分析

抗结核活性化合物HY-152E是本实验室前期获得的具有良好抗结核活性并拥有授权专利(ZL201210088290.0)的小分子化合物(最低抑菌浓度≤0.09μg/m L)。为深入探索HY-152E的抗结核机制,本研究利用药物亲和反应靶点稳定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)技术并结合蛋白质谱技术,分析可能与HY-152E相互作用的结核分枝杆菌潜在靶标蛋白。将结核分枝杆菌H37Ra的菌体蛋白裂解液与HY-152E共同孵育,用不同浓度的链霉菌蛋白酶消化30、45、60 min后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离并比较与HY-152E互作前后菌体蛋白耐受蛋白酶消化的差异条带,分别在相对分子质量70 000左右和45 000~55 000处观察到差异蛋白条带。利用蛋白质谱技术分析差异条带的蛋白信息,共获得86个蛋白信息。结合结核分枝杆菌数据库及蛋白功能信息,最终筛选到9个蛋白可能是HY-152E的抗结核作用潜在靶标。这些潜在靶标的确定,为后续研究HY-152E的抗结核分子机制奠定了基础。

新型抗结核活性化合物H37Ra的耐药菌筛选及其菌落表型

ATB-152E和ATB-152J为本实验室前期研究获得的具有良好抗结核活性的两种结构类似的小分子化合物,本文就其作用靶标及耐药机制进行探索。采用含药平板涂板筛选以及平板划线培养法逐步提高化合物浓度,分别筛选出结核分枝杆菌ATB-152E和ATB-152J耐药菌株。选取有代表性的耐药菌株,用微孔法测定结核分枝杆菌的最小抑菌浓度,分别对它们的菌落形态、生物膜形成等表型进行观察并与野生株进行比较。通过不断提高化合物筛选浓度最终筛选到ATB-152E耐药菌株17株、ATB-152J耐药菌株15株,这两种化合物的耐药频率均为10-7。生长表型结果显示,与野生株结核分枝杆菌相比,ATB-152E耐药菌菌落褶皱变多,ATB-152J耐药菌菌落形态更为扁平,褶皱变少。耐药菌的生物膜形成所需时间与野生株也存在差异,提示活性化合物耐药菌的突变可能导致细菌脂质代谢异常。ATB-152E和ATB-152J耐药菌的获得,为后续深入探索这两种具有良好抗结核活性化合物的作用机制奠定了基础。

抗耐药性结核病新药的先导化合物筛选

目的 采用结核分枝杆菌(Mtb)H37Rv对从上海陶塑生物科技有限公司购买的生物活性化合物库L4000进行抑制剂筛选,以获得具有成药前景的抗结核先导化合物。方法 采用已经建立的MtbH37Rv细胞水平的抑制剂高通量筛选模型对化合物库L4000的7285个样品进行筛选,并测定初筛阳性化合物对H37Rv以及临床多药耐药结核分枝杆菌的最低抑菌浓度,获得具有抗结核活性的阳性样品;进一步采用网络分析工具Swiss-ADME、Molsoft对阳性样品进行成药性分析。结果 从7285个化合物中共获得411个具有抗结核活性的化合物,初筛阳性率为5.64%;进一步测定它们对Mtb H37Rv、临床多药耐药Mtb 28和1731的最低抑菌浓度,获得24个具有明显抑制活性的化合物,总体阳性率为0.33%;采用Swiss-ADME对这24个抗结核化合物进行药化性质分析,并利用Molsoft对具有成药前景的化合物进行验证。最终获得具有成药前景的化合物LTBI371,该化合物对各种Mtb都表现出极强的抑制活性。结论 基于生物活性的化合物库开展抗结核药物筛选将更有可能获得对临床耐药Mtb具有抑制活性的阳性样品。

抗结核药物的研究现状及新进展

结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染病，主要累及肺，是传染病中单一导致死亡人数最多的疾病，也是最常见的与艾滋病相关的机会感染性疾病。MTB可侵入人体全身各脏器，经血源播散至脑、脊髓、肝、肾和肠等组织。结核病多见于免疫功能低下人群，包括HIV感染者，估计每年有800万肺结核新发病例，全世界每年有300万-400万人死于结核病，以发展中国家患者为甚。

海分枝杆菌基因随机高表达文库的构建及抗结核药物研发应用

目的:通过构建与结核分枝杆菌同源性高且安全性好的海分枝杆菌的基因随机高表达文库,为研究新型抗结核药物奠定基础。方法:通过构建双cos黏粒,利用噬菌体包装的方法构建高质量的海分枝杆菌基因随机高表达文库,研究和发现抗结核药物新靶标。结果:成功构建海分枝杆菌基因随机高表达文库,并利用已知作用机制的抗结核药物D-环丝氨酸、环丙沙星对海分枝杆菌基因随机高表达文库进行验证,证明了本基因随机高表达文库可以用于寻找抗结核药物的作用靶标。结论:建立了一种能够用于抗结核药物靶标研究的海分枝杆菌基因随机高表达文库,使用临床用抗结核药物证明该文库可以用于新型结核药物研发。

气相色谱火焰光度法检测TBI-166中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯残留量

目的:建立创新药物E-10-(4-三氟甲氧基苯基)-2,10-二氢-3-(2-甲氧基-3-吡啶)氨基-2-(反-4-甲氧基环己基)亚胺吩嗪(TBI-166)中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯残留量的气相色谱检测方法。方法:采用DB-WAX毛细管色谱柱,柱温为程序升温(起始温度90℃,保持8 min,以6℃·min^(-1)升温至120℃,保持5 min),氮气作为载气,使用火焰光度检测器(FPD)检测。结果:硫酸二甲酯和硫酸二乙酯质量浓度分别在0.048 9~0.977 2μg·mL^(-1)和0.051 0~1.020 0μg·mL^(-1)范围内具有良好的线性,相关系数分别为0.997 2和0.998 0,平均回收率分别为100.1%和99.3%,检测限分别为0.049μg·mL^(-1)和0.020μg·mL^(-1);2批TBI-166原料药中均未检测出硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。结论:该法经方法学验证,适用于检测药物中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的残留。