抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA防治大鼠肝纤维化研究

目的探讨经门静脉注射抗结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)是否能在体内抑制大鼠肝CTGF基因表达及防治大鼠肝纤维化。方法雄性SD大鼠24只,均分成4组,模型组皮下注射40%CCl4(3ml/kg)及门静脉注射生理盐水,每3d1次,连续6周;预防组皮下注射CCl4及门静脉注射抗CTGFsiRNA(0.1mg/kg),每3d1次,连续6周;治疗组皮下注射CCl42周,随后再给予抗CTGFsiRNA及CCl44周;对照组门静脉注射生理盐水6周。于最后1次CCl4注射后3d行门静脉测压,并取血及组织标本,检测血清转氨酶、透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原(PⅢNP)浓度,应用RTPCR及Western印迹法检测CTGFmRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用HE及Siriusred胶原染色检测肝组织炎症及纤维化,应用偏光扫描对肝组织胶原染色面积进行定量。结果与模型组相比,预防组及治疗组大鼠肝组织CTGFmRNA及蛋白质表达显著下调,肝组织炎症、坏死及纤维化明显减轻,血清转氨酶、HA及PⅢNP浓度显著降低;预防组、模型组和治疗组的肝组织胶原染色面积分别为5.8%±0.8%、12.3%±0.8%和7.2%±0.9%(P<0.01);门静脉压力分别为(14.2±2.3)cmH2O、(20.6±5.8)cmH2O和(15.1±3.6)cmH2O(P<0.05),明显降低。结论经门静脉注射抗CTGFsiRNA能在体内显著抑制大鼠肝CTGF基因表达并能有效防治大鼠肝纤维化,提示抗CTGFsiRNA有潜力成为防治肝纤维化的一种新策略。

噬菌体展示技术筛选抗人结缔组织生长因子单链抗体

目的：通过免疫小鼠获得抗人结缔组织生长因子（ CTGF ）抗体的基因，构建抗人CTGF单链抗体（ scFv）噬菌体展示文库，并通过生物淘选获得抗人CTGF的单链抗体。方法抗人CTGF单链抗体噬菌体展示文库经过4轮富集筛选之后，得到抗CTGF单链抗体，用ELISA及基因测序检测CTGF单链抗体亲和力。结果经过4轮富集筛选，得到了抗人CTGF scFv；ELISA检测显示抗人CTGF scFv与CTGF具有高亲和力，基因测序显示抗CTGF scFv基因全长767 bp，编码255个氨基酸，具有和人CTGF结合的特异性。结论本实验通过噬菌体展示技术筛选出抗人CTGF单链抗体，为以后CTGF单链抗体的功能研究奠定基础。

抗人CTGF单链抗体噬菌体展示文库的构建

目的构建抗人结缔组织生长因子（CTGF）单链抗体（scFv）噬菌体展示文库。方法用重组人CTGF（rhCTGF）免疫balb／c小鼠，表达CTGF抗体后取小鼠脾脏获得B细胞，提取总RNA后反转录为cDNA，聚合酶链反应（PCR）获取重链可变区（vh）和轻链可变区（v1），vh和vl再次PCR装配为vl—linker．vh即scFv基因片段，并与噬菌粒PAKl00酶连接，形成含有抗结缔组织生长因子单链抗体基因的目的噬菌粒；电转化入大肠杆菌XLl-blue，加入辅助噬菌体扩增后，建立噬菌体展示库重组库。结果经过凝胶电泳及噬菌粒基因测序分析，证实成功构建了抗结缔组织生长因子单链抗体定向免疫库。结论成功的构建了抗结缔组织生长因子单链抗体库，为制备抗结缔组织生长因子单链抗体奠定基础。