DMD/BMD肌细胞抗肌营养不良蛋白免疫荧光组化研究

目的:研究Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者肌细胞中抗肌营养不良蛋白(dystrophin)的表达及其诊断意义。方法:采用免疫荧光抗体染色技术对5例DMD,2例BMD肌细胞中抗肌营养不良蛋白进行检测,以2例正常人的肌细胞作为以照。结果:对照组肌细胞膜上染色阳性,胞核及胞浆呈阴性;DMD患者肌膜完全无显色;BMD患者染色弱阳性,可见沿肌细胞膜分布的间断斑片状荧光带。结论:抗肌营养不良蛋白缺乏或表达异常是DMD/BMD基本病理基础。应用免疫荧光抗体染色法检测抗肌营养不良蛋白。

抗肌营养不良蛋白通过MAPK信号通路参与特发性肺纤维化发病机制的研究

目的结合生物信息学分析结果研究抗肌营养不良蛋白(DMD)在特发性肺纤维化(IPF)中的作用及分子机制。方法从GEO数据库下载IPF数据集GSE47460、GSE150910及GSE135893,验证DMD表达,随后下载IPF数据集GSE27957、GSE28042和GSE93606,分析DMD表达水平与IPF患者预后的关系。挑选GSE150910数据集,根据DMD表达水平的中位数,将样本分为DMD高表达组和DMD低表达组,采用R 4.1.3软件对2组基因进行差异基因分析,根据差异基因进行功能富集分析和通路预测。采用随机数字表法,将12只6~8周龄C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组,每组6只。实验组小鼠气管内滴注博来霉素(BLM)构建肺纤维化模型。取小鼠肺组织进行免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR),检测DMD的蛋白和mRNA表达水平。将A549细胞分为NC-shRNA组、BLM组、NC-shRNA+BLM组和DMD-shRNA+BLM组。应用蛋白质印迹法检测各组衰老相关蛋白p21、凋亡蛋白Bax、MAPK信号通路相关蛋白以及Ⅰ型胶原蛋白的表达,并应用衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测各组衰老细胞所占的比例,用流式细胞术检测各组凋亡细胞所占的比例。结果DMD在GSE47460、GSE150910及GSE135893数据集中均为高表达,并且主要表达于Ⅱ型肺泡上皮细胞内,高表达DMD患者预后更差。GSE150910数据集中,DMD高表达组和DMD低表达组共有147个差异基因,上述基因主要富集在细胞衰老和凋亡的生物学过程,富集的通路得分最高的是MAPK信号通路。RT-qPCR及免疫组织化学染色结果提示DMD在BLM诱导的小鼠肺纤维化组织中为高表达(均P<0.05)。BLM组A549细胞中的DMD蛋白表达高于NC-shRNA组和DMD-shRNA+BLM组(均P<0.05)。BLM组A549细胞的p21、Bax、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平高于NC-shRNA组和DMD-shRNA+BLM组(均P<0.05)。衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果提示BLM组A549细胞的衰老细胞的比例高于NC-shRNA组和DMD-shRNA+BLM组(均P<0.05)。流式细胞术结果提示BLM组A549细胞的凋亡细胞的比例高于NC-shRNA组和DMD-shRNA+BLM组(均P<0.05)。结论DMD在BLM诱导的小鼠肺纤维化组织内呈高表达,干扰DMD可以通过MAPK信号通路减轻BLM诱导的A549细胞衰老和凋亡,从而抑制IPF的进展。

杜氏肌营养不良症的治疗研究进展

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种x连锁的进行性致死性神经肌肉疾病,这种疾病无法治愈,预期寿命在30岁至50岁之间,死亡与心脏或呼吸并发症有关。近年来,DMD的治疗也取得了一些重要进展,极具前景的CRISPR/cas9介导的基因组编辑有望从基因水平彻底治愈DMD,本文将对DMD治疗的研究现状进行综述,并分析不同治疗策略在其治疗中的研究进展和潜力。

低氧性微损伤时大鼠腓肠肌抗肌营养不良蛋白和结蛋白的变化

为了观察低氧性微损伤时大鼠腓肠肌抗肌营养不良蛋白(dystrophin)和结蛋白(desmin)的变化特征及其调节机制,本实验将雄性Sprague-Dawley大鼠40只随机分为常氧对照组和10%氧浓度的低氧刺激1、2、4、7d组(n=8),每组各取2只大鼠进行伊文氏蓝(EBD)腹腔注射来检测肌纤维膜通透性,同时用异染ATP酶法鉴别EBD阳性肌纤维的类型;其余6只采用Western blot、RT-PCR和荧光法进行蛋白含量和基因表达等测定。结果显示,低氧第1天即出现EBD阳性纤维,主要为ⅡA和ⅡB型。各低氧组的EBD阳性细胞率和平均光密度均大于常氧对照组(P<0.05)。低氧第1天dystrophin和desmin蛋白显著增加或有增加趋势,第2天有所下降,第4天又急剧增加,第7天恢复至接近对照组水平,其变化呈波动性起伏;低氧组基因表达在第2天开始大幅度增加,与蛋白含量变化趋势相对应。除了低氧第2天外,其余各组钙激活中性蛋白酶(calpain)总活性均高于常氧对照组。热休克蛋白HSP70和HSP90分别在低氧第4天和第7天增加(P<0.05)。上述结果表明,机械应力并非细胞膜完整性破坏的唯一原因,但是仅靠低氧引起腓肠肌微损伤时的dystrophin和desmin变化与离心运动不一样,二者蛋白含量并没有出现明显的丢失。低氧性肌损伤的表现形式可能与肌纤维动员类型以及calpain活性有密切关系。

低氧训练诱导大鼠腓肠肌抗肌营养不良蛋白和代谢酶变化及延长高速力竭运动时间

本文旨在探讨抗肌营养不良蛋白(dystrophin)和膜通透性在低氧训练中的变化及其作用。8周龄的Sprague Dawley (SD)大鼠共72只,随机分为4组:常氧安静(normoxic non-train, NC)组、常氧运动(normoxic train, NT)组、低氧安静 (hypoxic non-train, HC)组、低氧运动(hypoxic train, HT)组;每组又随机分为3个亚组:无力竭亚组、低速力竭亚组和高速力竭亚组。常氧运动组和低氧运动组进行4周运动训练;低氧组在氧浓度为12.7% (相当于海拔高度4 300 m)的常压低氧环境下生活训练。训练4周后,对各组的无力竭亚组取材,分别测定腓肠肌组织的乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)活性和dystrophin含量以及血清LDH活性。其余大鼠分别进行力竭测验,记录力竭时间。结果显示,相对常氧运动组,低氧运动组大鼠体重增长减缓,而骨骼肌dystrophin水平无显著变化。低氧运动对MDH和LDH活性的作用明显。氧浓度和运动训练及其交互作用对MDH均有显著性影响(P<0.05),腓肠肌LDH仅受氧浓度的影响(P<0.05),而血LDH受氧浓度和运动训练交互作用的影响(P<0.05),表现为肌LDH活性下降,血清LDH活性增高。对于大鼠力竭时间,力竭测验速度、运动训练及其交互作用有显著影响(P<0.05),运动训练和氧浓度的交互作用也有显著影响(P<0.05),而氧浓度的作用没有显著影响。低氧运动组的高速力竭亚组力竭总时间大于常氧运动组的高速力竭亚组,而且在力竭测试中疲劳出现较早但恢复迅速。以上结果提示,低氧运动能够有效延长大鼠高速力竭运动的时间,其作用机制可能与低氧运动后膜通透性增加而引起的血LDH含量上升有关。

结蛋白和抗肌营养不良蛋白在老年腹股沟疝患者腹内斜肌中的表达及意义

目的探索结蛋白和抗肌营养不良蛋白在腹内斜肌中的表达与老年腹股沟疝(inguinal hernia,IH)发病的关系。方法选择40例老年IH患者为研究组,20例无IH的老年阑尾炎患者为对照组,术中取同一解剖部位的腹内斜肌活组织,应用HE染色和免疫组织化学及显微镜图象分析的方法,观察HE染色下肌组织的形态及免疫组化下检测肌细胞内结蛋白和抗肌营养不良蛋白的含量。结果(1)HE染色图像分析表明:两组肌肉组织的形态学改变经分级后比较(P<0.05),有统计学意义;(2)免疫组织化学和图像分析方法表明:老年IH患者中结蛋白的含量与对照组比较明显减少(P<0.05);老年IH患者中抗肌营养不良蛋白的含量与对照组比较明显减少(P<0.05)。结论老年IH腹内斜肌的肌组织有明显的退行性改变,其肌细胞内结蛋白和抗肌营养不良蛋白表达减少,可能是老年IH发病的机理之一。

疑似假性肥大性肌营养不良症患儿Dystophin基因缺失突变分析

目的了解中国汉族假性肥大性肌营养不良症(DMD/BMD)患儿基因缺失突变的特点。方法经PCR和20对引物,对964例疑似DMD/BMD患儿Dystophin基因外显子缺失突变类型及断裂点进行检测分析。结果有491例患儿(491/964,51.0%)存在基因缺失突变:其中75例基因缺失突变位于基因5’端区域(15.2%),402例基因缺失突变位于基因中央区域(81.7%),13例基因缺失突变范围跨越了以上两个区域(2.6%)。检测到以50、49、48号外显子缺失突变最为常见。74%患儿的Dystophin基因断裂点位于44～50号内含子,以44号内含子最多(21%)。结论 20对引物的PCR法能够检测超过半数的Dystrophin基因缺失突变,基因中央区缺失是中国汉族DMD/BMD患儿病例的主要基因缺失突变类型。

假性肥大型肌营养不良的遗传学研究概况

假性肥大型肌营养不良是神经肌肉系统最常见的Ｘ－连锁隐性遗传病。临床表现主要有假肥大型（ＤＭＤ）与良性假性肥大型（ＢＭＤ）两种类型。男性发病率分别约１／３５００与１／３０００。前者通常在２０岁左右死于呼吸、循环衰竭。后者寿命较长。１ＤＭＤ基因与ＤＭＤ...

基因测序结合STR连锁分析在假肥大型肌营养不良症产前诊断中的应用

目的假肥大型肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy(DMD/BMD)是一种X-连锁隐性致死性遗传病,尚无特异性治疗方法,建立一套适合于DMD基因点突变产前诊断及早期产前诊断的方法,为携带者产前诊断提供有效的基因诊断途径,以避免患胎的出生。方法 27例DMD基因点突变携带者妊娠期取绒毛组织或羊水进行风险胎儿的DMD基因测序、DNA-STR分型和性别基因检测。结果 27个风险胎儿中,检出DMD患胎6例,其中无义突变3例,移码突变2例,剪接位点突变1例;检出携带者胎儿8例,其中移码突变4例,无义突变3例,剪接位点突变1例;13例为正常胎儿。27例中11例是通过绒毛膜穿刺活检进行,其余为羊膜腔穿刺羊水检查。结论基因测序结合STR连锁分析用于用于DMD点突变的产前基因诊断是目前一种准确和可行的方法。可成功地避免患病胎儿的出生,并能明确区分DMD基因纯合子和杂合子突变,避免正常胎儿被错误淘汰。

胎儿肌肉来源细胞的分离及其成肌分化研究

目的观察胎儿肌肉来源细胞(f MDC)体外成肌分化能力以及在mdx鼠体内再生抗肌营养不良蛋白。方法使用含10%新生牛血清的DMEM/F12培养液,采用预贴壁方法从胎儿肌肉组织中分离f MDC。采用免疫染色鉴定肌肉特异标志的表达。肌内注射f MDC到6.5 Gy照射3 d后的mdx小鼠股直肌,1个月后采用免疫荧光染色法和RT-PCR方法检测人抗肌营养不良蛋白和基因的表达。结果采用预贴壁方法可从胎儿肌肉组织中分离到贴壁生长、梭型的f MDC。可在f MDC的一些长纤维细胞包浆中检测到MHC的表达,在一些细胞胞核中检测到成肌素的表达。可在注射f MDC的mdx小鼠肌肉中检测到人抗肌营养不良蛋白和基因的表达。结论 f MDC中存在MHC和成肌素的阳性表达,注射f MDC到照射过的mdx小鼠体内可以再生抗肌营养不良蛋白表达。

骨骼肌细胞骨架蛋白研究综述

随着研究的逐渐深入和实验技术的改进,人们对细胞骨架有了丰富的认识。细胞骨架包括微丝、微管和中等纤维,其在细胞中具有多种重要的生物学功能。在骨骼肌细胞中细胞骨架按位置不同分为肌小节内、肌小节外和肌细胞膜骨架蛋白。结蛋白desmin是骨骼肌细胞中主要的中等纤维,是重要的骨架蛋白。整联蛋白integrins和抗肌营养不良蛋白dystrophin复合物通过亚细胞膜分子和跨膜分子将骨骼肌的收缩成分与细胞外基质相连。细胞骨架能稳定肌小节结构,由于肌节过度伸展或蛋白酶激活可能会损伤骨架蛋白。这些可能是运动训练造成肌肉微损伤和骨骼肌疾病症状,例如肌营养不良症的机制。

DMD/BMD缺失基因的检测及其表达产物的变化

目的:检测Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因缺失及其表达产物———抗肌营养不良蛋白在肌细胞中的变化,探讨其与临床病情的关系。方法:应用9对引物多重PCR技术对42例DMD/BMD患者进行基因检测;并采用免疫荧光抗体染色技术对5例DMD,2例BMD肌细胞膜上抗肌营养不良蛋白的表达观察分析,以2例正常人的肌组织作为对照。结果:共发现21例外显子缺失,缺失片段长度各异,其中16例(76.2%)累及中央缺失热区,5例(23.8%)位于5′端缺失热区,尤以48号外显子缺失频率最高。5例DMD患者胞膜抗肌营养不良蛋白染色阴性,其中1例未检出基因缺失,但抗肌营养不良蛋白无表达。2例BMD患者染色弱阳性,可见间断斑片状荧光带。结论:DMD/BMD病情轻重可能与基因缺失的数量和片段大小不呈平行关系,而是与外显子的缺失类型有密切关系;基因的表达受个体差异的影响,呈高度的遗传异质性。抗肌营养不良蛋白缺乏或表达异常是造成DMD/BMD表型的病理基础,其临床后果不仅取决于缺失程度,还取决于缺失区域的功能意义。

DMD/BMD基因诊断及其临床分析(附33例报告)

目的:研究Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者致病基因外显子缺失的分布特点及其与临床表现的关系。方法:利用9对引物以多重PCR技术对33例DMD/BMD患者进行致病基因诊断。结果:9对引物外显子缺失总检出率为45.5％,主要分布在中央缺失热区和5′端缺失热区,其中以45、48号外显子缺失最多见。且缺失片段长度各异。结论:(1)该病病情轻重可能与基因缺失的外显子数量及片段大小不呈平行关系,而与某些外显子缺失有关。(2)致病基因的表达也受到个体差异的影响,呈高度的遗传异质性。

DMD/BMD患者的dystrophin基因表达研究

目的探讨杜氏进行性肌营养不良(DMD)/贝氏进行性肌营养不良(BMD)患者的dystrophin基因突变与蛋白质表达之间的关系。方法用多重连接探针扩增(MLPA)法检测14例DMD/BMD患者dystrophin基因突变,肌肉活检观察组织的形态结构特点,免疫组织化学染色检测患者腓肠肌组织中dystrophin蛋白的表达情况。结果 14例DMD/BMD患者中有3例检出dystrophin基因缺失,其余未检出基因突变。肌肉活检结果显示,14例患者均可见肌纤维大小不一,圆形化,肌纤维明显变性、坏死,不同程度再生;部分肌纤维间可见少量炎性细胞浸润,结缔组织增生。免疫组织化学染色显示,3例未表达dystrophin基因突变患者的肌纤维膜dystrophin蛋白不同程度表达减弱,其余11例患者可见肌纤维膜dystrophin蛋白质表达完全缺失。结论 MLPA联合肌肉活检及免疫组化染色可以鉴别诊断DMD/BMD,为患者的诊治和预后提供了依据。

运动性肌纤维dystrophin、desmin的变化特征

采用文献资料法,对运动引起肌肉损伤时dystrophin、desmin的变化特征进行综述。大量研究表明,骨架蛋白dystrophin、desmin是保持肌细胞完整性的重要结构,与运动性肌损伤(EIMD)密切相关。但是这些研究大多是围绕离心运动引起EIMD和DOMS进行的。