转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B.juncea var.gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F1对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F1都携带了相应的抗性基因。F1的适合度研究表明,两种F1种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F1杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。

转基因抗草甘膦油菜籽中FMV 35S启动子的检测研究

对 FMV3 5 S和 FMV3 4S、Ca MV3 5 S启动子的 DNA序列进行了同源性分析 ,并设计引物对转基因抗草甘膦油菜籽中转入的 FMV3 5 S启动子进行了检测 .从 7船进口加拿大油菜籽检出 FMV3 5 S启动子基因 .

进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆中CP4-EPSPS基因的检测比较研究

由于国际上对转基因产品的安全性存在较大争议 ,因此对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。本研究以进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆为材料 ,通过比较分析外源的CP4 EPSPS基因的核苷酸序列和表达的氨基酸序列 ,设计出两对不同的引物 ,采用PCR方法分别对转基因油菜籽和大豆中外源的CP4

抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究

[目的]携带抗性基因回交后代的适合度是抗除草剂转基因作物的抗性基因能否成功逃逸到野生近缘种的重要依据。本文研究抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的回交3代子1代(BC_3F_2)和子2代(BC_3F_3)在田间条件下的适合度,为转基因油菜基因漂移的生态风险评估提供有价值的参考。[方法]以野芥菜、抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC3F3为材料,研究在低密度(每区15株)和高密度(每区30株)单种及不同种植比例(野芥菜、回交后代的混种比例分别为4∶1、3∶2和1∶1)混种条件下,野芥菜与BC_3F_2和BC_3F_3的总适合度。[结果]单种条件下,BC_3F_2的总适合度均与野芥菜无显著性差异。混种条件下,种植比例为4∶1时,BC_3F_2在2种密度下的总适合度均显著低于野芥菜;在混种比例为3∶2和1∶1条件下,BC_3F_2在低密度条件下的总适合度与野芥菜相当,而在高密度下的总适合度显著低于野芥菜。BC_3F_3在各种种植条件下的总适合度均与野芥菜无显著差异。[结论]BC_3F_2的总适合度受种植密度和比例的影响,在低密度3∶2和1∶1混种比例下的总适合度与野芥菜相当;BC_3F_3的总适合度不受种植密度和比例的影响。抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC_3F_3都具有在野外生存定植的可能性,且BC3F3定植的可能性较BC_3F_2更大。因此在防范转基因油菜基因逃逸的策略上,除防范初始杂交发生外,也应该防范回交后代的产生。

转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源E93'终止子的检测研究

对转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源基因E93'终止子进行了普通PCR和Taq Man实时荧光PCR检测,建立了相应的检测方法。

GOX-CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究

利用Genome walking方法在孟山都抗农达油菜(Brassica napus L.)中克隆了GOX-CP4EPSP双顺反子结构。利用农杆菌介导的遗传转化方法将PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物双元表达载体转化甘蓝型油菜Pol CMS恢复系"7-5"获得转基因植株。在田间对转基因植株喷施400倍的农达(41%草甘膦异丙胺盐),所有的转基因家系都能存活,而非转基因Pol CMS恢复系"7-5"全部死亡。在转基因植株叶片中能够检测到GOX和CP4EPSP基因的表达。对转基因T1代3个家系在60 mg/L草甘膦培养基上的发芽试验以及GUS染色分析表明抗草甘膦的单株能表达与GOX-CP4EPSP共转化的GUS蛋白质,而对草甘膦敏感的单株和野生型对照植株都不能表达GUS蛋白质。鉴于GOX-CP4EPSP双顺反子在转基因油菜中的有效性和稳定性,可以作为双子叶植物遗传转化的筛选标记。

转基因抗草甘膦油菜的检测方法

目的:建立检测田间转基因抗草甘膦油菜的方法。方法:用CTAB法提取DNA,经PCR分别扩增内参基因BnACCg8,及抗草甘膦外源基因CP4-EPSPS、FMV 35S启动子和E9 3'终止子等4种基因的片段,以琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析比对。结果:抗草甘膦油菜中分别扩增出与外源基因FMV 35S启动子、E9 3'终止子和CP4-EPSPS大小一致的片段。结论:该方法能有效地用于转基因抗草甘膦油菜的检测。

新型抗广谱性除草剂草甘膦转基因油菜的创制及其鉴定

草甘膦是世界上应用最广泛的广谱性除草剂,目前我国还没有自主知识产权的抗草甘膦油菜品种。本研究利用农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法,将新型抗草甘膦基因I.variabilis EPSPS转入甘蓝型油菜品系J9707中,获得了126株阳性转化株,阳性率为97.0%。这些转化单株中的T-DNA插入以单拷贝为主(占44.8%)。通过反向PCR确定了EPS-2、EPS-6和EPS-7等油菜转化体中T-DNA插入位置,并设计转化体特异性引物对它们的T0~T3代材料进行检测,证明了它们的T-DNA在基因组水平上整合的稳定性。RNA和蛋白水平的表达分析证实,I.variabilis EPSPS转基因及其蛋白产物在各转化株系不同世代能够稳定表达。苗期进行不同剂量的除草剂喷施处理发现,EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和EPS-7等株系可耐受4倍田间推荐使用剂量的草甘膦。本研究所创建的新型抗草甘膦油菜种质资源将为我国抗除草剂油菜品种培育奠定了重要基础。

一种抗草甘膦转基因油菜的快速鉴定方法

为建立一种快速鉴定抗草甘膦转基因油菜的方法,以抗草甘膦转基因油菜品系及后代分离群体为研究材料,利用不同草甘膦浓度滤纸平板进行种子发芽,观察抗性材料和非抗性材料幼胚抗性反应表型,并通过PCR和苗期草甘膦处理进行抗性验证。结果表明,利用0.5~1 g/L的草甘膦溶液处理的抗性材料胚根根毛生长正常,而非抗性材料胚根生长迟缓且光滑无根毛;利用该浓度的处理BC1和F2抗性分离群体,幼胚根毛有无性状分离比符合1:1和3:1,幼胚个体的基因组PCR扩增结果与根毛有无呈共分离。通过观察在该浓度草甘膦发芽处理后的幼胚根毛有无,可有效区分抗草甘膦转基因油菜的抗性和非抗性材料。本研究建立的鉴定方法不仅能够对抗草甘膦油菜材料进行快速、准确鉴定,而且能保证材料成活,对抗草甘膦转基因油菜育种和种子纯度鉴定提供技术参考。

分子标记辅助选育甘蓝型油菜抗草甘膦除草剂恢复系

田间杂草是影响油菜产量的一项重要因素。使用化学除草剂是目前最为主要的除草方法,但除草剂施用不当会造成油菜不同程度的药害,从而影响油菜的生长发育与产量,因此培育油菜抗除草剂的种质资源有着重要的意义。本研究以含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因的油菜品系甲HX6作为供体,与特早熟、特晚熟甘蓝型油菜品系1704、3660进行杂交,通过90 mg/L的农达异丙胺盐制剂(41%)进行筛选及PCR检测,选择对草甘膦表现抗性和含有732 bp抗性基因的植株,再以1704和3660作为轮回亲本,通过前景、背景选择的方法快速获得含有抗性基因的春性特早熟与特晚熟甘蓝型油菜品系,为抗除草剂油菜品种的培育提供资源。

抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子4代的适合度

为深入研究抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交后代适合度,分析抗性基因是否渗入近缘杂草野芥菜中,研究了抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子4代(BC3F_5)在2种种植方式(单种,野芥菜与回交后代等比例混种)及2个种植密度(低密度为15株/3m2,高密度为30株/3m2)下的适合度。结果发现,在单种和低密度等比例混种条件下,抗性BC3F_5的各适合度成分以及总适合度均已达到与野芥菜相当的水平;在高密度等比例混种时,BC3F_5R(抗草甘膦的BC3F_5)与野芥菜的各适合度成分以及总适合度均无显著差异,但BC3F_5L(抗草丁膦的BC3F_5)的主要适合度成分和总适合度均显著低于野芥菜。相关性分析结果表明,野芥菜和抗性BC3F_5的主要适合度成分与种植密度显著相关。因此结论认为,抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子4代在自然环境条件下的生存能力强,抗草甘膦转基因油菜的抗性基因漂移到野芥菜可能引起的生态风险比抗草丁膦转基因的生态风险更大。因此防范转基因作物的基因逃逸不仅要防范转基因作物与近缘杂草的初始杂交,而且要防范杂交后代与杂草的回交。

野芥菜向抗除草剂转基因油菜基因流动的研究

采用人工授粉的方法,分别以转基因抗草丁膦和抗草甘膦油菜为母本,野芥菜为父本,研究野芥菜的基因流动到转基因油菜中的可能性。结果表明,野芥菜和抗草丁膦及抗草甘膦油菜的亲和性指数明显低于其自交授粉的亲和性指数,只有0.44和0.54。经除草剂筛选和PCR检测证明,所有F1都携带了相应的抗性基因并表现出对相应除草剂的抗性。对F1的适合度研究表明,两种F1种子萌发率及营养生长情况和野芥菜没有明显差异,但结实明显下降,携带抗草丁膦基因的F1和携带抗草甘膦基因的F1每个角果饱满种子粒数分别是0.50和0.61。分别以两种F1为母本,野芥菜为父本进行回交,结实仍然很低,携带抗草丁膦基因的F1和携带抗草甘膦基因的F1与野芥菜回交每个角果饱满种子粒数分别只有0.35和0.33。上述结果表明,野芥菜基因流动到两种抗性油菜的可能性均比较小。

抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代的适合度

【目的】抗除草剂转基因油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)的抗性基因一旦成功漂移到近缘杂草中,将会给农田杂草防除带来很大的困难。转基因油菜的近缘杂草野芥菜(wild B.juncea,AABB,2n=36)广泛分布于中国西部地区并沿长江流域扩散,因此有必要深入研究抗除草剂转基因油菜与野芥菜回交后代的适合度,为抗性基因是否能成功漂移到近缘杂草中提供试验依据。【方法】在田间以不同密度(低密度为15株/区,高密度为30株/区)单种和混种(野芥菜与回交后代以4﹕1、3﹕2、1﹕1比例混种)野芥菜及抗性回交3代子3代(抗草甘膦转基因油菜及抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代分别表示为BC_3mF_4R、BC3p F4R和BC_3mF_4L、BC_3pF_4L,m表示以野芥菜为母本的回交后代,p表示以野芥菜为父本的回交后代),测定抗性正反回交3代子3代的营养生长(株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量)和生殖生长(单株有效角果数、单株种子质量、角果长、每角果饱粒数)的适合度成分,并比较供试回交后代的总适合度与野芥菜的差异。【结果】在单种条件下,BC_3mF_4R和BC_3pF_4R的各适合度成分及总适合度均与野芥菜无显著差异;尽管在高密度下BC_3mF_4L和BC3p F4L的茎粗、地上部单株干生物量和单株有效角果数显著低于野芥菜,但BC_3mF_4L和BC_3pF_4L的总适合度仍与野芥菜无显著差异;因此,在单种条件下,抗草甘膦或抗草丁膦的回交3代子3代在低密度和高密度均具有与野芥菜相当的总适合度。当回交后代与野芥菜混种时,在低密度3种比例混种下,抗草甘膦和抗草丁膦的回交3代子3代的总适合度与野芥菜无显著差异;在高密度3种比例混种下,BC_3 F_4R与野芥菜的各适合度成分及总适合度无显著差异,但BC_3 F_4L的株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量、单株有效角果数、单株种子质量及总适合度均显著低于野芥菜。相关性分析结果表明,BC_3 F_4的各适合度成分仅与种植密度相关。【结论】抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子3代都具有在野外生存定植的可能性,且抗草甘膦的回交3代子3代比抗草丁膦的回交3代子3代的可能性更大。因此,在防范转基因油菜的基因逃逸时不仅要防范转基因油菜与近缘杂草的初始杂交,而且要防范杂交后代与近缘杂草的不断回交,以免产生适合度较高的回交后代。

抗草甘膦转基因油菜和野芥菜回交1代子2代-子6代在无除草剂选择压下的适合度

抗草甘膦转基因油菜和野芥菜回交1代子2代-子6代在无除草剂选择压下的适合度转基因作物的抗性基因能否成功渗入野生或近缘杂草取决于携带转基因回交后代的适合度。为深入了解转基因油菜(Brassica napus)向野芥菜(wild B.juncea)基因流动的生态风险,本文研究了在低密度(5株/m^(2))和高密度(10株/m^(2))下,以及单种和混合种植(野芥菜:BC1F2R-BC1F6R=1:1)下抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交1代子2代到子6代(BC1F2R-BC1F6R)的适合度;并分析回交后代的适合度成分、种植密度和种植方式之间的相关性。研究结果表明:在单种低密度下,与野芥菜相比,回交1代子2代(BC1F2R)和子3代(BC1F3R)具有较低的适合度,而回交1代子4代-子6代(BC1F4R-BC1F6R)具有较高的适合度;无论是单种还是混种,高密度下所有回交后代的适合度均低于野芥菜。相关性分析结果显示,种植密度和种植方式对回交后代(BC1F2R-BC1F6R)的适合度成分有显著影响。这些结果表明,转基因从栽培油菜渗入到野芥菜很大程度上取决于回交后代的特定生长环境。

利用小孢子胚离体培养筛选抗除草剂的油菜

本文选用4个甘蓝型油菜（Brassiea napus L．）F（7039，7040，282和5102）为小孢子培养供体材料，分别对小孢子胚在含草甘膦和盖草能的培养基上进行培养，以筛选出抗草甘膦和抗盖草能的胚状体，进而获得再生植株。其中，基因型7039和7040用于草甘膦筛选，282和5102用于盖草能的筛选，