抗莱克多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

莱克多巴胺(RAC)经化学修饰引入功能基团羧基,合成半抗原RAC-戊二酸酐半醛化合物(RAC-SA),用混合酸酐法(MA)将RAC-SA偶联于牛血清白蛋白(BSA),合成人工抗原BSA-RAC,用红外(IR)、紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)对其进行鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC的单克隆抗体(RAC mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb,并鉴定其免疫学特性。结果表明,BSA-RAC偶联成功,偶联率为24.5:1;筛选出3F10、3H12、4D8共3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株间接ELISA效价细胞培养上清为1:1.28×103,腹水为1:6.4×105,同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为1.65×1010L/mol,对RAC的半数抑制浓度(IC50)为5.7ng/ml,与多巴酚丁胺的交叉反应率(CR)为22.3%,与其他化合物无CR。

莱克多巴胺单克隆抗体非亲和层析法纯化研究

抗体纯化对免疫测定和生物偶联的灵敏度、重现性和稳定性具有重要影响。本文对硫酸铵沉淀法(Ammonium sulfate precipitation,AS)及AS分别与阴离子交换层析法(Anion exchange chromatography,AEC)、阳离子交换层析法(Cation exchange chromatography,CEC)、疏水作用层析法(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)和陶瓷羟基磷灰石法(Ceramic hydroxyapatite,CHT)联合应用纯化腹水来源的莱克多巴胺单克隆抗体(Ractopamine monoclonal antibody,RAC-mAb)进行了研究。优化缓冲液pH、盐浓度及层析介质,分别采用Bradford法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、间接竞争酶联免疫吸附试验(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)和胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochromatography,CGIC)对抗体纯化后回收率、纯度及生物学活性进行评估。结果显示,采用AS+AEC法纯化抗体回收率高、纯度和生物学活性好,抗体回收率为40.1%,纯度为75.1%,经icELISA平行测定3次所得灵敏度(IC_(50))最佳为1.73±0.22 ng/mL,CGIC测定其在PBS及猪尿样本添加cut-off值分别为5 ng/mL和60 ng/mL。本研究为单克隆抗体纯化提供了理论参考和必要的实验基础。

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺（RAC）偶联于牛血清白蛋白（BSA）,合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒（RAC-Kit）,并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数〈15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。

莱克多巴胺单克隆抗体的研制

莱克多巴胺(Ractopamine)与戊二酸酐、氯甲酸异丁酯反应后,与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得2株稳定分泌抗莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水,间接ELISA方法测定腹水抗体效价为1∶3.2×107。该抗体与克仑特罗交叉反应率为0.3%,体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。获得的单克隆抗体可用于肉品中莱克多巴胺残留检测和莱克多巴胺残留检测试剂盒的开发。

莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(Rac)与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描确定偶联成功,测得偶联物Rac-KLH浓度为3.6 mg/mL,Rac-BSA浓度为6.2 mg/mL。以偶联物Rac-KLH作为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。以Rac-BSA作为包被抗原,经间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行多次亚克隆,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9、1F3、2C11、5C3、3A10、4A8、6B7、6D5、7C11、7D3。其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价1∶500 000,对莱克多巴胺的半数阻断浓度(IC50)均为3.98 ng/mL,对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的IC50均大于2 000 ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的交叉反应率均小于0.2%。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺在0.5～100 ng/mL范围内为线性分布,确定的最低检测限为0.5 ng/mL。

莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定

为了对莱克多巴胺进行酶联免疫法测定,经由混合酸酐法合成莱克多巴胺免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤单克隆化技术最终得到了1株名为3E1-C9-E10的能稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA测定,细胞培养上清的效价为1×105,腹水的效价达1×107以上,与多巴酚丁胺有24%的交叉反应率,与沙丁胺醇、克伦特罗没有交叉反应率。

莱克多巴胺单克隆抗体的制备及特性鉴定

莱克多巴胺与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞杂交,获得1株能稳定分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水,间接ELISA方法测定腹水抗体效价为1∶30 000。该抗体与莱克多巴胺的交叉反应率为100%,与克仑特罗的交叉反应率为0.01%。该单克隆抗体可用于对动物肉品或尿液中莱克多巴胺残留检测试剂盒或试纸条的开发。

莱克多巴胺多克隆抗体的制备

采用多元酸酐法活化盐酸莱克多巴胺,用混合酸酐法将活化的莱克多巴胺与载体蛋白(KLH,BSA)偶联,制备了莱克多巴胺免疫原KLH-Rac和包被抗原BSA-Rac。以KLH-Rac免疫新西兰白兔获得了莱克多巴胺多克隆抗体,以BSA-Rac为包被抗原,采用间接ELISA检测抗血清,其效价达到1∶6 000,间接竞争ELISA测得抗血清的IC50值约为5 ng/mL,其与克伦特罗、沙丁胺醇、特布它林的交叉反应性小于0.01%。

抗莱克多巴胺多克隆抗体的制备

为了制备抗莱克多巴胺多克隆抗体,试验通过连接剂butane-1,4-diol diglyciydyl ether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔,饱和硫铵沉淀方法纯化抗体,间接ELISA法检测抗血清效价。结果通过免疫兔获得了抗莱克多巴胺的多克隆抗体。经ELISA测定,其效价为1∶12800。

莱克多巴胺免疫抗原与多克隆抗体的制备

采用碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)法将莱克多巴胺(RAC)与活化的牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成了免疫抗原(RAC-BSA),经聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外吸收法鉴定偶联成功。用合成的免疫抗原免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体,采用所得抗体和辣根过氧化酶标抗原建立莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA),标准曲线呈典型S型,具有良好的线性关系。

莱克多巴胺抗体的制备与评价

本文以RAC-linker-BSA为免疫抗原获得了莱克多巴胺的多克隆抗体,用混合酸酐法合成包被抗原,建立了莱克多巴胺的间接竞争酶联免疫检测方法(ELISA),并对抗体性质进行了评价。结果表明,制备出的莱克多巴胺抗体具有较高的灵敏度,IC_(50)为0.9ng/mL,检出限(IC_(15))为0.1 ng/mL,低于同类文献的报道结果;除了与多巴酚丁胺的交叉反应为7.5%外,与克伦特罗、沙丁胺醇、特步他林、异丙肾上腺素和异奎胍均无交叉现象,说明抗体特异性较高;此外,抗体具有很好的稳定性,可在4℃冰箱中储存半年以上。为建立酶联免疫快速检测方法,实现对莱克多巴胺的有效监控奠定了良好的基础。

莱克多巴胺人工免疫原合成及抗体特性

将莱克多巴胺(RAC)进行化学修饰引入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的RAC-戊二酸酐半醛化合物(RAC-SA);采用混合酸酐法(MA)将RAC-SA与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫原BSA-RAC和包被抗原OVA-RAC,用红外(IR)、紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,推算分子结合比;用BSA-RAC免疫新西兰白兔,间接ELISA测定多克隆抗体(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,琼脂双扩散试验、WestGold膜杂交试验和交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为24.5∶1;获得了高价、敏感、特异的RAC pAb,为RAC残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。

莱克多巴胺的抗原合成鉴定及其抗体的制备纯化

莱克多巴胺属于β-兴奋剂类药物中的苯乙醇类衍生物,具有显著改善动物饲料利用效率,显著提高胴体瘦肉率的生产性能,因为其具有严重的副作用所以目前该类药物在我国和其他国家是被禁用的。本试验通过连接剂butane-1,4-dioldiglyciydylether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原,并采用紫外全波长扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的方法对合成的抗原进行了鉴定。通过免疫兔子获得了RCT的多克隆抗体,然后又通过饱和硫铵沉淀和proteinA-Sepharose4B的方法对抗体进行了纯化。纯化的抗体表现出对RCT较高的特异性和灵敏性。

5-羟色胺抗独特型单克隆抗体的功能鉴定

对5-羟色胺（5-HT）抗独特型单克隆抗体的功能进行鉴定．方法：细胞培养法，免疫组织化学ABC法和形态计量法．结果：培养平滑肌细胞显示5-HT受体免疫反应阳性，在正常培养基培养的平滑肌细胞的平均长度为（18．8±35．4）μm．培养基中含不同浓度的5-HT抗独特型单克隆抗体（分别为0．01％，0．03％，0．10％，0．30％，1％抗体原液），平滑肌细胞的平均长度分别缩短为（175．6±43．3）μm，（16．2±46．2）μm，（116．9±25．8）μm，（89．5±22．8）μm，（79．9±21．6）μm，除含0．01％抗体原液组外均比正常组有非常显著的差别（P＜0．01）．结论：该抗独特型单克隆抗体具有与5-HT相类似的诱导平滑肌收缩的功能，5-HT受体可能介导了这种功能．

N-乙酰-D-乳糖胺、抗CD28单克隆抗体对肺癌患者来源的CIK细胞增殖及杀伤功能的影响

目的:观察N-乙酰-D-乳糖胺联合抗CD28单克隆抗体对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖及杀伤功能的影响。方法:提取32例肺癌患者的外周血单个核细胞,分为对照组、抗CD28单克隆抗体组、N-乙酰-D-乳糖胺组及抗CD28单克隆抗体和N-乙酰-D-乳糖胺联合组(联合组),依据CIK细胞培养流程培养和分组处理后于第4、8、10、12、14天测定各组细胞增殖,第14天测定IL-2、IL-10、γ干扰素及肿瘤坏死因子-α的分泌及对K562细胞的杀伤作用。结果:抗CD28单克隆抗体、N-乙酰-D-乳糖胺单独作用均能促进CIK细胞增殖及IL-2及肿瘤坏死因子-α的分泌,增加效应细胞(CD3^+CD8^+细胞)的比例,增强CIK细胞对K562细胞的杀伤能力(P<0.05),但二者联合没有协同效应(P>0.05)。结论:N-乙酰-D-乳糖胺与抗CD28单克隆抗体均能增强CIK细胞增殖及杀伤功能,但二者无协同作用。

RAC-OVA抗原和抗RAC单克隆抗体的筛选

在进行酶联免疫反应实验操作过程中,为了保证材料质量及使用的延续性,在使用前分别对两对抗原抗体进行了筛选和评价。主要是从抗体灵敏度的测定、抗体特异性的测定和抗体效价的测定这三个方面来选择灵敏度好、特异性强和效价高的一对抗原抗体。其中抗体灵敏度的测定中,单位1(江南大学)的抗体IC50的平均值为3.22μg/L,灵敏度较好;两家单位的莱克多巴胺单克隆抗体的特异性都较好;单位1的抗体效价为1:32000,效价较高。最终选择江南大学提供的RAC-OVA抗原,原始浓度为10 mg/mL,抗莱克多巴胺单克隆抗体的原始浓度为9.8 mg/mL。

抗3种β-激动剂双特异性单克隆抗体的建立及鉴定

制备抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺双特异性抗体并初步鉴定。将分泌抗克仑特罗、沙丁胺醇抗体的细胞株和分泌抗莱克多巴胺抗体的细胞株分别驯化,使之成为HAT敏感株。将两者融合,筛选分泌双特异性单克隆抗体的杂交-杂交瘤株,然后对其进行初步鉴定。共获得5株杂交-杂交瘤细胞株,将其分泌的双特异性单克隆抗体(BsAb)经过酶联免疫吸附法(ELISA)初步检测,IC50可达1 ng/mL,腹水效价为105以上,用ELISA法证明BsAb只与克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺有特异性反应。该方法制备简单、风险低、灵敏度高、周期短,具有较好的应用前景。

克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制

本试验旨在研制同时检测克伦特罗(CL)和莱克多巴胺(RAC)的多残留胶体金免疫层析试纸条(Multi-strip)。用细胞融合技术筛选CL和RAC杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,金标抗体竞争性膜层析技术研制Multi-strip。该试纸条由样品垫、偶联垫、双检测线和质控线标记的NC膜、吸收垫等几部分构成,其中偶联垫上灌注有CL和RAC两种金标单克隆抗体,双检测线由检测抗原CL-OVA和RAC-BSA喷膜构成,间距2mm。结果表明:多残留试纸条的CL和RAC目测检测限分别为1和2ng·mL-1,检测时间5～8min。基质呈阳性的真实样品用单残留试纸条、ELISA和GC-MS检测,结果一致,无假阳性或假阴性案例。该试纸条具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于现场检测和筛选。