草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

斑节对虾新型抗菌肽ALF-like基因克隆表达及其抗菌功能分析

【目的】克隆并明确斑节对虾(Penaeus monodon)新型抗菌肽ALF-like基因(PmALF-like)的结构特征、组织表达分布规律及副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激后的表达变化,探究其在抗菌先天免疫中的作用与功能,为阐明斑节对虾抗菌免疫调控机制提供参考依据。【方法】依据PmALF-like基因表达序列标签(EST)序列,利用RACE扩增获得PmALF-like基因cDNA全长序列,通过ProtParam、SignalP 5.0、MegAlign和MEGA 7.0等在线软件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测PmALF-like基因在斑节对虾不同组织中的表达特征及其在副溶血弧菌刺激后的表达模式;利用原核重组方法获得PmALF-like成熟肽的重组蛋白(去信号肽),并通过液体培养基法和牛津杯法等探究Pm ALF-like成熟肽抑制细菌生长的作用。【结果】PmALF-like基因cDNA序列全长1242 bp,包括45 bp的5’端非编码区(5’-UTR)、798 bp的3’端非编码区(3’-UTR)和399 bp的开放阅读框(ORF),共编码132个氨基酸残基;分子量为15.26k D,理论等电点(pI)为7.67;利用SignalP5.0对PmALF-like蛋白进行信号肽预测,结果表明其第18个氨基酸处存在信号肽剪切位点。实时荧光定量PCR检测结果表明,PmALF-like基因在斑节对虾血淋巴、肝胰腺、鳃、肠道、肌肉等组织中均有不同程度的表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,血淋巴次之,肌肉组织中的相对表达量较少。副溶血弧菌刺激后,斑节对虾肝胰腺组织PmALF-like基因产生免疫应答,其基因相对表达量在6~72 h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调。利用原核表达方法在体外成功获得不含信号肽的PmALF-like成熟肽,借助液体培养基法和牛津杯法发现PmALF-like成熟肽对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的生长均有明显抑制作用。【结论】PmALF-like基因在斑节对虾各组织中广泛表达,其成熟肽对维氏气单胞菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌的生长具有明显抑制作用。

中华乌塘鳢NK-lysin基因的克隆鉴定、表达分析及抗菌功能研究

NK-lysin是一种具有广谱抗菌活性和免疫调节功能的阳离子抗菌肽。通过分子克隆方法获得中华乌塘鳢的NK-lysin基因(BsNKL)cDNA序列。BsNKL编码152个氨基酸,包含1个信号肽、1个SapB结构域和6个保守半胱氨酸残基。基因表达分析表明,BsNKL在主要器官组织中均有表达,副溶血弧菌感染能够引起BsNKL表达量在脾脏、头肾和鳃中发生显著变化。中华乌塘鳢BsNKL抗菌肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌等4种细菌均具有较好的抑菌活性。腹腔注射BsNKL能够为细菌感染的中华乌塘鳢提供有效的免疫保护并显著提高其存活率。综上所述,BsNKL在中华乌塘鳢抗细菌感染天然免疫应答方面发挥重要作用。

黏虫新型抗菌肽Mysdiap基因克隆、序列分析及原核表达

利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列,利用生物信息学软件对该序列进行分析,并用原核表达体系对其进行诱导表达,为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明,成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因,命名为Mysdiap(GenBank登录号:AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5′端和3′端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明,Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒,并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达,表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右,以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上,从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列,并在大肠杆菌中成功诱导其表达。

俄罗斯鲟肝脏表达抗菌肽2基因的分子特征及抗菌活性分析

肝脏表达抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2,LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2(Acipenser gueldenstaedti LEAP-2,AgLEAP-2)的全长c DNA序列,对其序列特征和表达水平进行了分析;构建Ag LEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化;进一步采用琼脂稀释法初步检测Ag LEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示,AgLEAP-2基因c DNA全长为622 bp,开放阅读框(ORF)为246 bp,预测编码81个氨基酸,分子量约为11.2 kDa,5′端非编码区为184 bp,3′端非编码区为192 bp。Ag LEAP-2包含一个信号肽(1~25 aa)和一个成熟肽(26~81 aa),成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基,在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达,在肝脏中表达水平最高,在肠道和肌肉中表达水平次之,在鳃中表达量最低。与0 h相比,Ag LEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外,重组Ag LEAP-2蛋白(r Ag LEAP-2)在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明,AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果,本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。

萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达

试验采用RT-PCR方法,从萝卜叶子中克隆得到抗菌肽基因AFP(antifungal protein)。该基因全长240个碱基,79个氨基酸。经测序证明克隆所得基因与GeneBank中发表的原序列一致。将此抗菌肽基因克隆到E. coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 ODD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达。

基于LC-MS/MS和比较基因组学技术解析海洋源解淀粉芽孢杆菌CMT-9产抗菌脂肽的分子机理

为探究海洋源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CMT-9产抗菌脂肽的分子机理。采用高效液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术检测CMT-9发酵液的主要组分,结合Illumina高通量测序解析CMT-9的全基因组信息,并将其与B.velezensis CMT-6、B.amyloliquefaciens DSM7T、B.velezensis FZB42和B.subtilis 168中脂肽合成相关的代谢通路和关键基因进行比较分析。结果表明,CMT-9的发酵液含有表面活性素、伊枯草菌素、芬荠素3种脂肽。全基因组测序分析发现,CMT-9菌株染色体的基因组全长为3928149 bp,G+C含量为43.39%,tRNA数量为83,rRNA为9。通过GO、KEGG、COG数据库比对,其差异基因主要富集在碳水化合物代谢和氨基酸代谢等合成脂肽的相关通路;脂肽谱相近的菌株CMT-9、CMT-6、FZB42在基因组组分、G+C含量、共线性、同源性和共有基因中均表现出高度的一致性。该研究通过LC-MS/MS和比较基因组学技术联用解析芽孢杆菌脂肽谱的差异及其分子机理,以期为脂肽高产菌株的筛选及基因库的构建提供理论基础。

抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株

建立了樱桃（PrunuspseudocerasusLindl．）矮化砧木茎尖高频再生系统，并利用根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导将gus及抗菌肽基因导入樱桃矮化砧木，获得19个转化株系。经Southernblot检测证明，抗菌肽基因已整合到樱桃的基因组。转基因植株接瘤实验、gus基因表达产物的颜色反应及叶片提取液对根癌土壤杆菌C58的抑菌实验表明，抗菌肽基因在转化植株中可能已得到有效表达，试管苗具有明显的抗根瘤病特性。还研究了茎尖分生组织的种质转化特点，结果表明它是一个较好的转化系统，可获得较高的转化频率。

应用基因枪将蚕抗菌肽基因导入水稻获抗白叶枯病株系

将天蚕抗菌肽Ｂ基因应用基因枪法导入水稻发芽种胚，获得转基因植株。经Ｂａｓｔａ抗性鉴定，应用ＰＣＲ技术和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分折表明，抗菌肽Ｂ基因已整合到水稻的基因组。Ｔ３抗白叶枯病株系Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分折证明抗菌肽Ｂ基因在ＲＮＡ水平有表达。

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因 ,将其C末端改造为Asn编码 ,改造后的抗菌肽CecropinAD基因克隆到 pPICZα_A载体上 ,构建成酵母重组分泌型表达载体 ,转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)受体菌GS115中 .采用zerocin抗性标记筛选重组转化子 ,经摇瓶发酵 ,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测 .结果表明 ,改造后的CecropinAD基因在毕赤酵母中获得了表达 ,表达产物经α_Factor信号肽引导分泌到胞外 ,具有较强的杀菌活性 .

樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化

以优良樱桃砧木新品系 98 1、Colt、大青叶为试材进行叶片离体再生及根癌农杆菌介导遗传转化 ,建立了高频率再生系统 ,并获得抗菌肽转基因植株。诱导叶片再生的最佳培养基为MS附加BA 1.0～2 .0mg/L、NAA 0 .3～ 0 .5mg/L、GA 0 .5mg/L、AgNO3 5 .0～ 10 .0mg/L。农杆菌及受体感受态是影响转化的关键 ,延迟筛选可提高叶片中转化细胞对卡那霉素的抗性而利于再生。PCR及SouthernBlot检测为阳性 ,表明抗菌肽基因已整合到樱桃砧木 98 1基因组。

马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及其抗晚疫病的初步鉴定

为获得抗晚疫病的转基因马铃薯植株,采用根癌农杆菌介导法,以微型薯薯片为外植体,将萝卜抗菌肽基因(AFP)导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)中,通过草甘膦抗性筛选和PCR检测获得了4株转基因试管苗,并经黑暗诱导获得了微型薯。采用离体叶片接种法,对微型薯长出的叶片进行抗晚疫病鉴定,结果表明这4个株系的抗病性均有一定程度的提高。

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟草的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能,对烟草等茄科作物的青枯病假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)具有较强的杀菌效果。人工合成抗菌肽基因(122 bp)转入根癌农杆菌(Agrobnctcrium tumefaciena),感染烟草叶盘,诱导成苗。通过对卡那霉素敏感筛选,胭脂碱脱氢酶检定及抗菌肽片段探针杂交,确认抗菌肽基因已转入烟草。现正研究其在烟草中表达及抗青枯病的可能性。

家蝇生长发育各阶段抗菌肽基因表达情况的研究

目的从基因角度分析家蝇生长发育各阶段抗菌肽的表达情况。方法制备家蝇卵以及Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄幼虫、蛹和成虫等6个生长阶段的总RNA,采用半定量RT-PCR技术,以磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因作为内参照,根据GenBank公布的家蝇抗菌肽基因-天蚕素(cecropin)基因、防御素(defensin)基因和攻击素(attacin)基因的核苷酸序列设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析家蝇生长发育各阶段抗菌肽基因mRNA表达量。结果上述6个生长发育阶段均检测到cecropin、defensin和attacin等3种抗菌肽基因的表达,分别在210、300和650bp出现一条带,与其理论值相符。其中Ⅲ龄幼虫期和成虫期抗菌肽基因mRNA的表达量最高(3种抗菌肽基因电泳图谱扫描光密度与内参基因GAPDH光密度的比值分别为1.61、1.99和1.62,1.47、1.92和1.59),卵期、Ⅰ龄幼虫期和蛹期表达量相对较低(3种抗菌肽基因电泳图谱扫描光密度与内参基因GAPDH光密度的比值分别为0.49、0.49和0.42,0.72、0.49和0.64,0.65、0.39和0.91)。结论家蝇抗菌肽基因在不同发育阶段均普遍表达,但表达水平存在明显差异。

抗菌肽AD基因的合成

设计并合成了一种新型抗菌肽基因，合成的抗菌肽（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）ＡＤ基因全长１４０个碱基对，克隆于ｐＣＲＴＭ２１载体上，经ＤＮＡ序列分析证实，合成的ｃｅｃｒｏｐｉｎＡＤ基因的碱基序列与设计序列完全一致．

家蚕抗菌肽基因研究进展

抗菌肽是昆虫先天性免疫系统中十分重要的效应因子,近年来一直是昆虫免疫学研究的热点。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,其抗菌肽研究取得了长足进展。根据已经研究获得的抗菌肽基因序列在家蚕基因组中进行同源搜寻,共获得了40个家蚕抗菌肽基因。这些基因编码的多肽在大小、氨基酸组成和性质上差异很大,但基于结构性质可以分成3类:(1)具有α-螺旋结构并且缺乏半胱氨酸(cysteine,Cys)的线性抗菌肽;(2)富含脯氨酸或甘氨酸的组成性抗菌肽;(3)富含半胱氨酸的环形抗菌肽。以这3类结构作为主线,综述了家蚕抗菌肽近年来的研究进展。

抗菌肽基因导入桑树获得抗病转基因植株

用携带抗菌肽基因的农杆菌处理桑子叶，在含有羧苄青霉素（Cb）400～500mg／L和卡那霉素（Km）20mg／L的MS培养基上，有32.4％的子叶产生了不定芽；66.5％的不定芽在含有Cb300mg／L和Km30～40mg／L的培养基中,正常生长成2～3cm高的新稍；新梢在含Cb50mg／L和Km10mg／L的生根培养基中有72．6％形成完整根系。3次转化共获得12个株系55株KmR植株。不同株系桑苗叶片DNA点杂交分析显示，7个株系有阳性杂交信号。KmR株系桑苗的抗病性测定显示，5个株系共14株桑苗对青枯病具有较强抗性.

天蚕抗菌肽A与蜂毒素杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的克隆与表达

根据天蚕抗菌肽A(cecropinA ,CA)N端第 1～ 7个氨基酸残基、蜂毒素 (melittin ,M )N端第 5～ 12个氨基酸残基 ,以大肠杆菌偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～ 7) -M(5～ 12 )基因 ,同载体 pGEMEX - 1连接后转化大肠杆菌JM 10 9,经打点杂交筛选和序列测定 ,获得一个与设计一致的克隆。将此克隆中的质粒亚克隆至JM10 3(DE3) ,经IPTG诱导、BrCN切割和抑菌圈试验表明 ,克隆的杂合肽基因在JM 10 9(DE3)中获得了表达。

东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性。方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段。PCR产物与pMD18 T连接,得到阳性重组载体pMD18 Myticin A。Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K Myticin A转化至宿主菌中。得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达。发酵上清进行Tricine SDS PAGE分析并用CM sepharose柱和Sephadex G 25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性。结果:获得重组载体pPIC9K Myticin A。高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K Myticin A经甲醇诱导后,Tricine SDS PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上。Western印迹法证实所表达样品为Myticin A。表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用。结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长。

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

运用基因枪法将含有 bar基因和 cecropin B基因的质粒 p CB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞 ,筛选后得到 3株转基因植株。PCR检测和 Southern杂交结果表明 ,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对 Basta很强的抗性 。