天蚕抗菌肽B基因的化学合成及克隆

用化学合成法,我们设计、合成了一个以植物偏爱的遗传密码子编码的天蚕抗菌肽B基因。通过把该基因与M13mp19噬菌体载体重组、克隆;转化大肠杆菌JM103,杂交检测和序列测定,得到二个与设计一致的克隆。

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

运用基因枪法将含有 bar基因和 cecropin B基因的质粒 p CB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞 ,筛选后得到 3株转基因植株。PCR检测和 Southern杂交结果表明 ,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对 Basta很强的抗性 。

转抗菌肽B基因水稻植株的获得与鉴定

构建了一个适合在水稻中表达含有抗菌肽Ｂ基因的转化载体（ｐＣＢ１），应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚，获得了一些转基因水稻植株。根据对选择标记基因和目的基因的分子检测和抗病性测定，证明抗菌肽Ｂ基因已整合入转化水稻基因组并在转基因水稻中表达了抗病性。

天蚕抗菌肽B基因嵌合表达载体的构建及其对桑树和烟草的转化研究

致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种天然的植物转化系统。根据其Ti质粒(Tumor Inducing plasmid)转移整合的分子机制,已构建了一系列外源基因的嵌合表达载体,并在一些植物中表达这些外源基因。 谢毅等按照植物偏爱的遗传密码子编码,已人工合成了天蚕抗菌肽B基因。此抗菌肽B是一种具有广谱性很强的体内外杀菌作用的昆虫免疫多肽。

抗菌肽A与抗菌肽B空间构象的喇曼光谱分析

通过抗菌肽Ａ与抗菌肽Ｂ两种分子的粉末固体状态、水溶液状态空间构象的喇曼光谱分析，表明这两种抗菌肽具有不同的主链构象，在固态中分别以无规卷曲、α螺旋为主，在水溶液中分别以α螺旋、β结构为主．两种分子在水溶液中Ｃ－Ｓ侧链构象分别为扭式与反式．但色氨酸侧链环境分析表明，两种分子在水溶液中均为色氨酸残基处于部分或完全暴露状态。

转抗菌肽B基因水稻(Oryza sativa L.)植株的再生

通过研究除草剂Basta对水稻品种台安 1号愈伤组织生长的影响 ,确定了能抑制愈伤组织生长的最低剂量 ;在此基础上将抗菌肽B基因 (cecropinB)和bar基因导入了台安 1号基因组。除草剂抗性鉴定结果表明 :转基因植株表现出对Basta较强的抗性 .

抗菌肽B基因导入水稻及转基因植株的鉴定

构建了一个适合在水稻中表达的含有抗菌肽B基因的转化载体(pCB1),应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚,获得了一些转基因水和植株.Basta抗性鉴定,抗菌肽B基因PCR扩增分析,点渍印迹和Southern印迹分析结果表明,选择标记基因(bar)和抗菌肽B基因都已整合入转化水稻基因组中,Northern印迹分析证实了抗菌肽B基因在RNA水平上的表达.转基因水稻植株增强了对水稻白叶枯病和细条病的抗性.

应用基因枪将蚕抗菌肽基因导入水稻获抗白叶枯病株系

将天蚕抗菌肽Ｂ基因应用基因枪法导入水稻发芽种胚，获得转基因植株。经Ｂａｓｔａ抗性鉴定，应用ＰＣＲ技术和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分折表明，抗菌肽Ｂ基因已整合到水稻的基因组。Ｔ３抗白叶枯病株系Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分折证明抗菌肽Ｂ基因在ＲＮＡ水平有表达。

双价抗菌肽基因表达载体的构建

将人工合成的抗菌肽Ｄ基因和抗菌肽Ｂ基因克隆到同一植物表达载体ｐＢⅠ１２１，且各自具有其３５ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子。先将抗菌肽Ｄ基因及其启动子和终止子克隆到ｐＢ１２１ＨｉｎｄⅢ位点获得ｐＥＣＶⅠ重组子。然后将抗菌肽Ｂ基因克隆到ｐＥＣＶⅠ的ＢａｍＨⅠ位点，经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定获得具有抗菌肽Ｄ，抗菌肽Ｂ基因的双价基因表达载体ｐＥＣＶⅡ。

柞蚕抗菌肽cecropin B的结构和抑菌活性及基因表达分析

抗菌肽对昆虫抵御病原微生物的侵染具有重要作用。使用在线软件分析成熟的柞蚕抗菌肽cecropin B高级结构,并与鳞翅目其他昆虫抗菌肽进行聚类分析。利用巴斯德毕赤酵母体外表达柞蚕cecropin B,并测试重组柞蚕cecropin B的抑菌活性。采用qRT-PCR方法检测3个不同品种柞蚕蛹在柞蚕肠球菌、柞蚕核型多角体病毒和柞蚕微孢子虫感染情况下,体内cecropinB基因的转录表达情况。结果显示,柞蚕cecropin B成熟肽的N端和C端分别有1个α螺旋结构,聚类分析将柞蚕cecropin B归为昆虫抗菌肽cecropin B亚型;柞蚕cecropin B在巴斯德毕赤酵母工程菌中得到体外表达,重组柞蚕cecropin B具有体外抑菌活性;柞蚕肠球菌感染的不同品种柞蚕蛹的cecropinB基因转录表达水平均上调,柞蚕核型多角体病毒或柞蚕微孢子虫感染的不同品种柞蚕蛹的cecropinB基因转录表达水平有明显差异,提示柞蚕cecropin B在柞蚕抵抗不同病原微生物的感染过程中可能具有不同的作用。

新型融合基因hIFNα1-CB在大肠杆菌中表达

目的 构建人干扰素 α1和抗菌肽 B的融合蛋白表达质粒 p HC,并初步研究融合蛋白的抗病毒活性。方法 重组质粒 p HC转化 E.coli JM83 ,温控诱导表达 ,SDS- PAGE制备蛋白质 ,病变抑制法测定其抗病毒比活性。结果 得到分子量约为 2 1ku的目的蛋白 ,抗病毒比活性为 2 .62× 10 6 IU/ m g。结论 成功构建了融合蛋白表达质粒 p HC,重组蛋白的构象及 C-端的

新型融合蛋白hIFNα1-CB表达载体的构建

目的 :构建人干扰素α1(hIFNα1)和抗菌肽B(CB)的融合蛋白表达质粒。方法 :将人工改造后的hIFNα1基因与CB基因按正确的阅读框架融合 ,并定向克隆至大肠杆菌表达载体pBV2 2 0。结果 :经PCR检测及质粒的限制性分析 ,所挑选的Amp抗性菌落均含有插入了hIFNα1 CB融合基因的重组质粒pHC。结论 :以pBV2 2 0为载体 ,成功构建了hIFNα1 CB融合蛋白表达质粒pHC。

双抗植物表达载体的构建

用限制性内切酶将抗虫的胰蛋白酶抑制剂（ＴＩ）基因从质粒ｐＢｉｎ２０上切下，插入带有抗细菌的抗菌肽Ｂ和抗菌肽Ｄ基因的植物表达载体ｐＤＢ３的ＸｂａⅠ位点。通过点杂交和酶切鉴定，得到了带有３个抗性基因的双抗植物表达载体ｐＤＢＴ．

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽种胚 ,获得转基因植株 2株 .转基因水稻T1～T55个世代不同株系 ,对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究 .结果表明 :转基因后代株系barR∶barS 大部分符合 3∶1分离比率 .T1、T4 转基因株系PCR、Southern印迹分析表明 :T18株有抗菌肽B基因 ;T4 仍有 4个株系有抗菌肽基因 ,其他的株系基因丢失 .T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达 ;抗菌肽B转基因水稻对白叶枯病的抗病性有提高 ,抗性能传递到高世代 ,在T3

转基因水稻目的性状稳定性的研究

本文根据分子杂交的证据，确认转基因水稻株以后，用人工接种白叶枯病病菌的办法，从转入抗菌肽 Ｂ（ Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ） 基因的水稻种子后代中筛选出抗性植株。连续３ 年，用人工接种病原菌的办法检测抗性植株有性后代的抗病性。结果表明，转基因水稻有性后代的目的性状（ 抗白叶枯病） 并不一致，出现敏感、中感、中抗等分离，而从有性后代中选出中抗植株后，中抗株的有性后代能保持目的性状的稳定性。