源自螺旋藻渣枯草芽孢杆菌发酵抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌抑菌机制对比研究

目的:研究枯草芽孢杆菌发酵螺旋藻渣的发酵液中分离出的抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。方法:采用紫外分光光度法、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法和原子吸收光谱法研究抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响;采用考马斯亮蓝法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳考察抗菌肽对金黄色葡萄球菌胞内蛋白合成及对基因组DNA结合作用的影响,并通过模拟细胞膜的疏水环境探究抗菌肽发挥抑菌作用时其二级结构的变化情况。结果:抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素均能引起金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加,导致胞内钾离子释放量、蛋白质泄漏量及细胞膜疏水性增加,但抗菌肽SP-AP-1的抑菌效果更为显著(P<0.05);两种抗菌肽均能抑制菌体蛋白合成,尤其对分子质量为17、20、25~35 kDa的蛋白抑制作用最为明显;虽然两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA没有明显阻滞作用,但增大抗菌肽质量浓度,SP-AP-1可与溴化乙锭竞争性结合DNA,使基因组DNA条带变暗,影响蛋白质的表达。本实验为螺旋藻渣抗菌肽拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究提供了理论参考。

抗菌肽F1高产菌株筛选鉴定及其对多重耐药菌生物膜形成的抑制作用

该研究以L.paracasei subsp.Tolerans FX-6为出发菌株,经过^(60)Coγ射线辐照诱变,筛选出一株高产抗菌肽F1的突变菌株(菌26)。对菌26进行16S rDNA序列比较分析发现其与FX-6具有高度相似性。进一步对菌26的牛奶发酵粗提物进行分离纯化,成功富集抗菌肽F1。通过抑菌实验发现,菌26的牛奶发酵粗提物对E.coli的最低抑菌质量浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)为3.16 mg/mL,较FX-6牛奶发酵粗提物的MIC降低了75%,同时抗菌肽F1的产量也提高了3.03倍,初步推断抗菌肽F1质量浓度与菌株的抑菌活性之间可能存在正相关关系。前期研究已经发现抗菌肽F1对黏菌素耐药大肠杆菌SHP45的MIC为320.0μg/mL,该实验进一步研究表明当抗菌肽F1的质量浓度达到2×MIC时,可抑制50%以上的黏菌素耐药大肠杆菌SHP45生物膜的形成。基于以上研究结果表明,菌26比出发菌株具有更高的产抗菌肽F1能力,且抗菌肽F1对黏菌素耐药大肠杆菌SHP45的生物膜形成具有显著的抑制作用。该研究为高产抗菌肽菌株的获得提供研究思路,并有望为多重耐药细菌感染的防控提供物质基础。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

牛膝多糖对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1 mRNA表达的影响

本文旨在探讨牛膝多糖(ABPS)对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1(PG-1)mRNA表达的影响。试验采用单因子设计,按照日粮处理因素不同,设对照组、抗生素组、0.05%、0.10%和0.15%牛膝多糖组,共5个处理。选用28日龄杜长大仔猪160头,随机分入5个处理,每个处理4个重复,每个重复8头猪(公母各半)。采用半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,检测PG-1mRNA相对表达量。结果表明:日粮中添加牛膝多糖均不同程度地促进断奶仔猪骨髓抗菌肽PG-1mRNA的表达。与对照组相比,0.05%、0.10%和0.15%牛膝多糖组分别使断奶仔猪PG-1mRNA的相对表达量增加14.9%(P>0.05)、36.4%(P<0.05)和7.3%(P<0.05);与抗生素组相比,其PG-1mRNA的相对表达量分别增加7.8%(P>0.05)、27.9%(P>0.05)和19.4%(P>0.05)。即牛膝多糖能显著促进断奶仔猪骨髓抗菌肽PG-1mRNA表达,且日粮中以0.10%添加量为适宜。

抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制

研究副干酪乳杆菌FX-6产抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内抑菌作用机制。通过凝胶阻滞电泳、荧光光谱考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌DNA的结合作用及方式,考马斯亮蓝法检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响,邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、荧光指示剂法分别测定抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶、非特异酯酶表达活性的影响,流式细胞仪分析F1对金黄色葡萄球菌细胞周期的影响。结果显示,抗菌肽F1能以嵌插方式与金黄色葡萄球菌细胞内的DNA结合,阻碍其遗传信息正常表达,使其蛋白的合成减少,并使胞内β-半乳糖苷酶、非特异性酯酶的表达活性减弱,胞内酶系统紊乱,影响其正常代谢,生长周期无法顺利进行,从而起到抑菌的效果。

抗菌肽Shiva-1基因的人工合成与克隆

参照抗菌肽 Shiva-1的氨基酸序列 ,兼顾鱼类、昆虫和大肠杆菌偏爱的密码子 ,设计了 Shiva-1基因序列 ,加上适宜基因工程操作的酶切位点 ,人工合成了 2条分别为 92 bp和 91 bp的寡聚核苷酸片段。经互补链延伸反应、Eco RI酶切 ,将完整的 Shiva-1基因反向克隆至 p UC1 8载体 ,经 PCR检测和序列分析证明 ,已正确克隆了抗菌肽

抗菌肽F1粗提物稳定性及其对荔枝保鲜研究

为了研究抗菌肽F1粗提物抗菌活性稳定性,并探讨其对荔枝的保鲜效果,将经过0.05%抗菌肽F1粗提物、0.1%抗菌肽F1粗提物及0.05%施保克浸泡处理之后的荔枝分别在(25±3)℃和(4±1)℃下贮藏。其中,(4±1)℃下的贮藏实验,增加了复合药液组(抗菌肽F1粗提物、施保克的比例为1∶1,两者终浓度为0.025%)。每隔一段时间,测定各组荔枝的好果率、褐变指数、质量损失率、硬度、可溶性固性物、还原糖、维生素C含量等指标。结果表明,抗菌肽F1粗提物能够存放较长的时间,耐冻融,对常见的金属离子具有一定的抵抗力,且几乎无溶血性,安全性高。另外,它能够抑制荔枝果皮褐变及果肉软化,延缓果肉可溶性固形物、还原糖和维生素C含量的下降,保持荔枝的良好品质。研究还发现,抗菌肽F1粗提物与施保克复合使用,比单一保鲜剂的保鲜能力更强。荔枝经复合药液处理之后,在(4±1)℃下贮藏到第21 d时,好果率高达71.43%。

白僵菌诱导家蚕抗菌肽enbocin1基因的表达特征及产物的抗真菌活性

家蚕的抗菌肽家族基因enbocin1是蚕体免疫系统相关基因。为解析家蚕对病原真菌感染免疫应答反应的分子机制,采用实时荧光定量PCR检测抗菌肽基因enbocin1在家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后的时空表达模式,结果显示:enbocin1主要在幼虫脂肪体中显著上调表达,而且持续至感染诱导后30 h,感染后8、30 h的表达水平分别上调了约44倍和6倍;在马氏管、体壁中该基因的诱导表达差异不显著,在血淋巴中几乎检测不到该基因的表达。进一步用原核表达系统成功表达并纯化获得了高纯度的重组家蚕抗菌肽enbocin1,体外抑菌试验表明其对白僵菌具有较强的抑菌活性,且重组enbocin1蛋白浓度与抑菌活性之间具有量效关系。用重组enbocin1蛋白制备了效价达1∶30 000的多克隆抗体,可用于进一步深入研究enbocin1的功能及其作用机制。研究结果提示抗菌肽enbocin1在家蚕抵御真菌感染的过程中可能具有重要作用。

断奶及日龄对仔猪骨髓组织抗菌肽Protegrin-1 mRNA表达的影响

本文旨在研究不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽Protegrin-1(PG-1)mRNA表达的差异及断奶对其表达的影响。分别于0(出生当天)、3、14、23、28日龄随机屠宰杜长大公猪4头,采集股骨骨髓组织。以18S rRNA作内标,用一优化的RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)方法进行半定量分析。结果表明:不同日龄仔猪骨髓组织PG-1mRNA相对丰度有明显的差异(P<0.05)。出生时最低,随着日龄的增加,其表达显著增加。断奶导致其显著下降(P<0.05),随着断奶日龄的增加,其表达又呈上升趋势。即不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽PG-1 mRNA表达存在显著性差异;断奶显著降低其表达。

杜仲抗菌肽EuCHIT1对白色念珠菌的抑菌作用及机制研究

目的:研究杜仲抗菌肽EuCHIT1对白色念珠菌的抗菌活性及机制。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)扩增EuCHIT1蛋白的编码区,构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,采用镍亲和色谱法纯化得到可溶性的EuCHIT1;采用二倍最小抑菌浓度(MIC)法稀释EuCHIT1并测定其对白色念珠菌的抑菌圈直径;采用荧光分光光度计和酶标仪分别检测EuCHIT1对白色念珠菌细胞膜的去极化作用及对细胞膜通透性的影响;通过鲎试验动态浊度法和高效液相色谱法分别测定白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖和麦角甾醇含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测EuCHIT1对白色念珠菌感染的SD大鼠肺上皮WTRL1细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。结果:纯化得到的杜仲抗菌肽EuCHIT1相对分子质量为77210,对白色念珠菌MIC值为32μg·mL^-1,EuCHIT1质量浓度与抑菌活性之间具有量效关系;EuCHIT1可增加白色念珠菌细胞壁的去极化及通透性,降低白色念珠菌细胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖及麦角甾醇的含量,同时EuCHIT1可降低白色念珠菌感染的WTRL1细胞中IL-6及TNF-α水平(P<0.05)。结论:EuCHIT1对白色念珠菌具有抑菌作用,主要机制可能是破坏细胞壁,导致细胞膜去极化、通透性增加,并降低白色念珠菌感染的肺上皮细胞IL-6及TNF-α水平。

抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达

利用绿色荧光蛋白 (GFP)基因与天蚕素 B突变体 ABP- S1基因的融合基因 ,构建了 2个原核表达载体 p Am GS1和 p Bm GS1,转化表达宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3)和 E.coli BL 2 1(DE3) p L ys S。结果 ,p Am GS1未能得到转化子 ,而p Bm GS1的转化子高效表达了融合蛋白 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检查 ,融合表达产物最高可占菌体总蛋白的49.45 %。表达产物经包涵体复性 ,柱层析初步纯化 ,通过平板抑菌试验 ,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌以及鱼类重要的致病菌嗜水气单胞菌等多种革兰氏阳性。

柞蚕抗菌肽CA_1的分离

应用FPLC、HPLC系统配合MALDI TOF MS等技术 ,分离得到一个以灭活的Escherichiacoli诱导产生的具有明显杀菌活性的柞蚕抗菌肽CA1。自动蛋白质序列分析仪测定其一级结构为WNPFKELERAGSRVRDAIISAGVAVATVAQATAILK ,含有 36个氨基酸残基 ,经联机检索 ,与cecropinD有 88%的同源性 ,仅有 4个氨基酸残基的差异 ,其中铰链区第 2 1～ 2 3位氨基酸为AGV ,与已知柞蚕抗菌肽A、D铰链区AGP有所不同 ,提示抗菌肽存在多态性。

抗菌肽Cecropin P1基因真核表达载体的构建

选择大肠杆菌偏爱密码子,人工设计合成3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因的全序列,并将其克隆到T-easy载体上,经双酶切重组于真核表达质粒pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和序列分析,抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建成功。抗菌肽Cecropin P1基因表达载体的成功构建,为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用等打下基础。

抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。

枯草芽孢杆菌BI1产抗真菌脂肽培养条件的优化

采用Plackett—Burman设计对枯草芽孢杆茵BI1产抗菌脂肽培养条件中相关影响因素(即种龄、接种量和pH值)的效应进行评价并筛选出重要的影响因素,然后用Box-Behnken设计及响应面分析确定了重要影响因素的最佳条件,优化后的溶血透明圈直径达到17.5 mm,比优化前的13.75 mm提高了27.27%。

外排泵抑制剂小肽1号对抗菌药抗菌活性的影响

为了观察外排泵抑制剂小肽1号对抗菌药抗菌活性的影响,本试验采用标准微量稀释法,测定了6类8种抗菌药单用和与小肽1号联用对12株临床分离鸡大肠杆菌的MIC值。结果表明,12株鸡大肠杆菌中有9株为产超广谱酶的多重耐药菌株,小肽1号(1∶2)使恩诺沙星等8种药物的抗菌活性多数增强2倍,使氟苯尼考对A8、A15的抗菌活性增强了4倍,小肽1号(1∶2或1∶4)使恩诺沙星、甲替沙星、环丙沙星的抗菌活性增强2倍,使左旋氧氟沙星对A13的抗菌活性增强4倍。以上结果表明,细菌外排泵抑制剂-小肽1号对大多数药物的抗菌活性有一定的增强作用,产酶多重耐药的鸡大肠杆菌至少同时存在产ESBLs、外排泵两种耐药机制。

东北林蛙重组抗菌肽dybowskin-1ST部分理化特性和生物学活性研究

目的：对具有广谱抑菌活性的东北林蛙（Rana dybowskii）重组抗菌肽dybowskin-1ST进行热稳定性、酸碱稳定性、局部过敏反应（Arthus反应）及溶血活性分析,为进一步摸清重组肽的理化特性及其应用提供科学依据。方法：将重组抗菌肽dybowskin-1ST分别置于不同环境温度（25~100℃）及不同酸碱环境（pH2~pH12）中处理4 h,观察其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌环直径,确定其稳定性;用不同浓度梯度的重组dybowskin-1ST进行溶血试验和局部过敏反应（Arthus反应）。结果：1.重组dybowskin-1ST在25~100℃温度及pH2~pH12环境下均有抑菌活性,其中,最适环境温度为25℃;重组dybowskin-1ST在pH3~pH7范围对Staphylococcus aureus抑菌活性较强（抑菌环直径为12.77~13.17 mm）,在pH3~pH8范围对Escherichia coli抑菌性较强（抑菌环直径为12.63~13.37 mm）。2.溶血试验结果显示,重组dybowskin-1ST对家兔红细胞的溶血率在0.14%~4.4%;小鼠Arthus氏试验观察其腹部皮下重组dybowskin-1ST注射部位红肿不明显,无出血、坏死等炎性反应。结论：实验结果显示重组dybowskin-1 ST具有较好稳定性、低溶血性及低致敏性,为其应用提供科学依据。

抗菌肽Dermadistinctin—Q_1的原核表达及其生物活性鉴定

试验对抗菌肽Dermadistinctin-Q1(DDQ1)进行原核表达,并对其生物活性进行检测。采用重叠区扩增基因拼接法,多步PCR获得抗菌肽DDQ1全基因,并使用原核表达载体pET-32a(+)构建工程菌。通过优化诱导表达时间和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度,实现融合蛋白表达条件最佳化。利用肠激酶从融合蛋白中分离抗菌肽DDQ1后,使用Ni离子亲和层析法进行纯化。进一步的生物活性检测表明,抗菌肽DDQ1具有广谱抗菌活性和一定的热、酸耐受性,是一类极具开发潜力的新型药物。

抗菌肽Shiva 1a基因真核表达载体的构建及序列分析

为了探讨天蚕类抗菌肽在动物早期抗感染过程中的作用机理,本研究以Shiva1a基因的成熟肽为模板设计4条引物,利用重叠延伸PCR技术获得目的基因,并在C端添加6×His的标签。将此序列与真核表达载体pIRES2-EGFP进行重组,构建pIRES2-EGFP-Shiva 1a重组表达质粒,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染将重组质粒转染到CHO-K1细胞,荧光显微镜观察其表达情况。通过生物信息学软件对抗菌肽Shiva 1a的二级结构和三级结构进行预测分析。其结果为进一步研究Shiva 1a的抗菌活性和在动物抗病育种方面的应用奠定了基础。

Ericin 1a抗菌活性小肽对肉鸡肠道、生产性能及经济效益的影响

本研究通过分析Ericin 1a抗菌活性小肽对肉鸡肠道、生产性能及经济效益的影响,旨在为肉鸡养殖减抗产品的筛选提供借鉴。研究采用单因素试验方法设计,在鸡群健康与疾病情况下分别选用360只同1d罗斯308肉鸡,按试验要求分别随机分为2组,每组设6个重复,每个重复30只鸡,公母各半,试验组利用饮水方式添加Ericin 1a抗菌活性小肽,添加量为60g/T水,饲养期全程添加;对照组全程不添加。饲养试验42d。结果表明,在28d体重及肠道发育方面,肉鸡健康生产状态下,试验组与对照组相比,体重无显著性差异,肠道发育除盲肠长度未增加外,十二指肠、空肠、回肠长度及各肠段相对长度均有所增加,空肠相对长度试验组较对照组增加6.34,呈显著性差异(P <0.05);在肉鸡发生疾病(20d始发生支气管堵塞)情况下,试验组与对照组相比,体重明显轻于对照组,肠道长度除回肠长度略高外,十二指肠、空肠、盲肠长度均略低,各肠段相对长度却均略高,但均未呈显著性差异(P> 0.05)。生产性能方面,鸡群健康生产情况下,试验组较对照组42d全期成活率、料重比、出栏均重分别高1.31%(P> 0.05)、0.02(P> 0.05)、180g(P> 0.05),欧指高27.93(P <0.05);在鸡群发生疾病生产情况下,试验组较对照组成活率、料重比、均重分别高5.58%(P <0.05)、0.05(P> 0.05)、50g(P> 0.05),欧指高18.42(P> 0.05)。经济效益方面,在鸡群正常生产与发生疾病生产条件下,单只投入成本为0.036元,分别获利增加1.11元、0.82元。结果提示,Ericin 1a抗菌活性小肽无论在健康或疾病条件下,均能促进肠道发育,并提高综合性生产性能指标欧洲效益指数,且表明在健康条件下,欧指体现更明显,在疾病条件下,成活率体现明显。进一步说明,Ericin 1a抗菌活性小肽能够明显提高肉鸡抵御疾病的能力,可在进行抗生素替代的进一步研究。