边缘革蜱AQPs重组蛋白的表达及抗蜱效果

对边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白(aquaporin,AQP)rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3纯化后免疫家兔,采血,进行Western blot和ELISA试验,第3次免疫2周后进行抗蜱试验。利用SDS-PAGE凝胶电泳筛选出rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3的最优表达条件,经HisSep Ni-NTA 6FF纯化柱将3种重组蛋白纯化,家兔分4组,每组3只家兔,对照组1组,免疫组3组。纯化的3种重组蛋白分别单独免疫3组家兔,在0、14、21d分别进行1次免疫,每隔7d采血1次,制备多克隆抗体,Western blot检测其反应原性,用ELISA检测其抗体效价,待抗体效价升高后开展攻蜱试验。结果显示,rDmAQP1的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃诱导8h;rDmAQP2的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃诱导7h;rDmAQP3的最优表达条件是IPTG浓度为1.0mmol/L、37℃条件下诱导5h。Western blot结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有一定的反应原性。ELISA结果显示rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3免疫家兔的抗体效价分别为:1∶409600、1∶51200和1∶409600,rDmAQP1蛋白免疫后总的抗蜱效果为79.74%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为9.43%、25.17%和63.81%;rDmAQP2蛋白免疫后总的抗蜱效果为78.78%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为8.30%、20.14%和68.26%;rDmAQP3蛋白免疫后总的抗蜱效果为87.91%,对边缘革蜱的平均饱血蜱质量、平均卵质量及平均卵孵化率的抑制率分别为3.23%、22.47%和80.50%。本研究通过血清学试验及抗蜱试验,发现rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3都具有抗蜱疫苗候选抗原潜力,其中rDmAQP3的免疫效果最佳,为rDmAQP1、rDmAQP2和rDmAQP3功能研究奠定了基础。

小亚璃眼蜱FER1基因的克隆表达及抗蜱效果

为挖掘抗蜱候选疫苗抗原,对蜱虫进行安全有效的防控。本研究旨在对小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)铁蛋白1(H.anatolicum ferritin1,HanFER1)基因进行生物信息学预测及分析,使用克隆技术和原核表达系统表达HanFER1,通过镍柱纯化法获取高纯度HanFER1,并对其进行模式动物免疫抗蜱试验。提取小亚璃眼蜱总RNA并反转录为cDNA,构建克隆载体pMD19-T-FER1和系统进化树,通过生物信息学分析其B细胞抗原性表位、跨膜区结构、亲疏水性、蛋白理化特性、信号肽和亚细胞定位;构建表达载体pET-28a-FER1,用His-Bind亲和层析柱获得纯化蛋白;使用rHanFER1免疫家兔,制备多克隆抗体,Western blot检测其免疫原性,用ELISA检测其抗体效价,待抗体效价升高后开展攻蜱试验。本试验中的小亚璃眼蜱FER1氨基酸序列与印度的小亚璃眼蜱(序列号:AFQ98383.1)为一支,且亲缘关系最近,相似达到约99%。B细胞线性抗原表位显示有较好的抗原性,该基因编码172个氨基酸,分子式为C_(878)H_(1 357)N_(237)O_(275)S_(9),相对分子质量为19.92 ku。理论等电点(pI)为5.13,为酸性蛋白;HanFER1蛋白无跨膜区信号肽;抗原性很高,为亲水性蛋白,并且HanFER1主要存在于细胞质(56.5%),其余分布在细胞核(26.1%)、线粒体(13.0%)。使用克隆技术克隆出了HanFER1基因片段长度为509 bp,成功构建了原核表达载体pET-28a-Ha-FER1,并经His-Bind镍柱亲和层析获得纯化HanFER1蛋白,FER1蛋白大小为25 ku,并且蛋白在浓度为0.8 mmol/L、最适温度为37℃的条件下诱导7 h左右表达量最高。Western blot结果显示该蛋白具有一定的免疫原性。ELISA结果显示rHanFER1免疫家兔的抗体效价为1∶12 800,rHanFER1蛋白免疫后总的抗蜱效果为73.43%,对小亚璃眼蜱的平均饱血蜱重、平均卵重及平均卵孵化率的抑制率分别为11.7%,23.0%和55.0%。本研究通过生物信息学分析、重组蛋白表达、血清学试验及抗蜱试验,发现HanFER1具有抗蜱疫苗候选抗原潜力,为HanFER1的功能研究奠定了基础。