双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统(two component system, TCS)的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示:cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量(LD_(50))分别为7.50×10^(5)、7.50×10^(6)、1.33×10^(6) CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。

cpxR基因对大肠杆菌E41株生物学特性及生物被膜形成的影响研究

为研究双组份系统cpxR基因缺失对大肠杆菌临床分离野生株E41生物学特性的影响、培养条件与其生物被膜(BF)形成能力的关系及黄芩苷对BF的清除作用,本研究以野生株E41、缺失株E41ΔcpxR、回补株E41ΔcpxR/pcpxR为对象进行试验。比较3株菌的生长特性,结果显示三者生长曲线无显著性差异。比较3株菌的运动性,结果显示E41ΔcpxR的游泳运动和群集运动能力弱于野生株及回补株。采用平板计数检测3株菌的抗鸡血清杀菌能力,结果显示E41ΔcpxR株抗鸡血清杀菌能力弱于野生株及回补株。采用微量肉汤稀释法检测菌株的药物敏感性,结果显示与野生株和回补株相比,卡那霉素、阿米卡星和环丙沙星对缺失株的MIC降低1/2,但氟苯尼考对其MIC升高了2倍。采用结晶紫染色法检测不同成膜载体和培养温度对BF形成的影响,结果显示3株菌均在硅胶载体上的BF形成能力最强,但25℃条件下适于E41和E41ΔcpxR/pcpxR株BF的形成,37℃条件下则更适于E41ΔcpxR株BF的形成。采用平板计数法检测黄芩苷对BF的清除作用,结果显示,不加黄芩苷的空白对照组,E41和E41ΔcpxR/pcpxR株在试验起始时就有菌株开始从BF中游离,而E41ΔcpxR在24 h才有菌株从BF中游离;加入1 MIC和1/2 MIC黄芩苷分别与3株菌共培养条件下,3株菌均在试验起始时即从BF中开始游离。但加入1/4 MIC黄芩苷时,E41和E41ΔcpxR/pcpxR株在试验起始时有菌株从BF中游离,E41ΔcpxR株在12 h开始从BF中游离。本研究结果表明,当cpxR基因缺失后,其运动性和抗血清杀菌能力降低,对氨基糖苷类、喹诺酮类和酰胺醇类药物的敏感性改变,硅胶载体更有利于菌株附着形成BF,黄芩苷对其BF有清除作用。本研究为探究大肠杆菌cpxR基因功能奠定了基础,同时也为BF抑制剂的研发提供了参考依据。

副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。【方法】以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD600-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。【结果】成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。【结论】lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。

副猪嗜血杆菌qseB、qseC双基因缺失株的构建及生物学特性

QseBC双组分系统(QseBC two-component regulatory systern)与细菌中的群体感应相关,是肠杆菌科和巴斯德氏菌科中的全局性毒力调控因子,但在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)中的作用还不清楚。本研究利用自然转化法构建SC1401的双基因缺失株(ΔqseBC)。比较缺失株(ΔqseBC)与野毒株(SC1401)的抗血清杀菌能力、生物膜形成、抗生素耐药性以及压力耐受能力。结果表明:ΔqseBC的生物被膜形成能力明显弱于SC1401。缺失株ΔqseBC的在猪血清中的存活率为55.12%,低于野毒株SC1401(83.76%)。ΔqseBC对恩诺沙星、庆大霉素、头孢噻呋和青霉素的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)明显下降。ΔqseBC对39和42℃高温,1、2、4、8和16 mmol·L^(-1)H2O2,以及50、100和150 mmol·L^(-1)NaCl表现出更高的敏感性。综上表明,QseBC双组分系统在副猪嗜血杆菌的血清抗性、抗生素抗性和胁迫耐受性中发挥了重要作用。QseBC可能与副猪嗜血杆菌的致病能力密切有关,但其具体机制还需要进一步研究。