血管发生抑制因子restin的克隆表达及其抗血管活性的初步研究

目的 :克隆人血管发生抑制因子restin(hRS) ,在E .coli中融合表达 ,并测定其抗血管活性。方法 :用RT PCR法从中国人胎盘组织中扩增hRS基因 ,重组入pGEM T载体中并测序鉴定 ,构建原核表达载体pGEX hRS ,表达融合蛋白GST hRS。融合蛋白经亲和纯化及凝血酶切后 ,采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验检测其抗血管生成活性。结果 :RT PCR产物为 5 64bp ,测序结果与Genbank中胶原XV(COL15A1)的C端序列一致 ,但在 2 1位 (TCT→TCG)引起丝氨酸的同义突变 ,82位 (ACA→TCA)引起丝氨酸突变为苏氨酸。诱导表达的人GST hRS融合蛋白经凝血酶切后 ,分子量为 2 0kD ,具有抗血管生成活性。结论 :hRS的成功克隆、表达为抗血管生成治疗实体瘤的研究奠定了实验基础。

肿瘤抑素抗血管活性相关肽的表达及活性研究

目的利用大肠杆菌表达系统表达肿瘤抑素抗血管活性相关肽-21肽,检测其生物学活性。方法人工合成21肽基因序列(肿瘤抑素75～95位氨基酸),克隆到表达载体pTYB2上,转化大肠杆菌BL-21(DE_3),酶切和测序鉴定后,用IPTG诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化21肽。通过MTT实验,细胞生长曲线测定,小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验及组织病理学切片研究其活性。结果获得的可溶性21肽对人脐静脉内皮细胞的生长具有抑制作用。小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验抑瘤率达42.86%。组织病理学切片结果可见H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少。结论经初步检测获得具有抗血管活性的21肽,为进一步研究肿瘤抑素的作用机制和肿瘤的临床治疗奠定了基础。

蜈蚣藻中一种硫酸半乳聚糖的分离纯化、结构鉴定及其抗新生血管生成活性

为了寻找多糖类血管生成抑制剂,我们以蜈蚣藻(Grateloupia filicina)为原料,经水提、醇沉、DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B凝胶柱层析分离纯化,得到一个均一多糖(GFP15).采用HPGPC、糖组成分析、绝对构型测定、甲基化分析、IR和NMR等技术对GFP15进行结构鉴定.结果表明,GFP15为一琼胶和卡拉胶中间型的硫酸半乳聚糖,主要由1,3连接的β-D-半乳糖和1,4连接的2,3位硫酸基双取代的α-D-半乳糖交替组成,1,3连接β-D-半乳糖的4位和6位上分别有少量的硫酸基取代,1,4连接的半乳糖有少量是α-L-半乳糖,此外,还有极少量的木糖、3,6-脱水半乳糖和6-甲基-半乳糖.利用鸡胚尿囊膜法(CAM)对GFP15进行抗新生血管生成活性评价,结果显示,GFP15(100μg/egg)能抑制尿囊膜新生血管的形成,提示GFP15作为一种多糖类血管生成抑制剂具有开发为抗肿瘤药物的潜在价值.

齐墩果酸和去氧胆酸衍生物合成及抗血管生成活性研究

目的合成齐墩果酸、去氧胆酸-丙酮基衍生物并评价2者对新生血管生成的影响。方法以丙酮/K2CO3作为反应体系,利用溴代川芎嗪分别与齐墩果酸和去氧胆酸发生亲核取代反应,得到齐墩果酸和去氧胆酸衍生物。采用鸡胚绒毛尿囊膜模型(chorioallantoic membrane,CAM)对其进行在体新生血管活性评价。结果产物结构经1H-NMR、13C-NMR及IR确证为齐墩果酸乙酰甲酯和和去氧胆酸乙酰甲酯;二者作用于CAM模型后,新生血管的数目均比空白组减少。结论在丙酮/K2CO3/溴代川芎嗪反应体系中,得到齐墩果酸和去氧胆酸-丙酮基衍生物;经CAM模型测试发现去氧胆酸-丙酮基衍生物对新生血管具有较好抑制活性。

1,3-二氢-1,3-二氧-2H-异吲哚类衍生物的合成及抗新生血管生成活性研究

根据整合素 αvβ3 受体内源性配基 RGD三肽构效关系和作用机制 ,以沙利度胺为先导化合物 ,设计并合成了 5个未见文献报道的 5 -羧基 -1 ,3-二氢 -1 ,3-二氧 -2 H-异吲哚类衍生物 ,其结构经元素分析、红外光谱及核磁共振谱确证 .体外初步生物活性筛选实验结果表明 ,部分目标物对脐静脉血管内皮细胞株 ( ECV30 4 )增殖有显著抑制活性 .

北苍术化学成分及其血管新生抑制活性

目的研究北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的化学成分及其血管新生抑制活性。方法北苍术95%乙醇提取物采用大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、TLC、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT法测定其对人脐静脉内皮细胞HUVEC的细胞增殖抑制活性。结果从中分离得到11个化合物,分别鉴定为seco-愈创木酮(1)、gibberodione(2)、junipercamphor(3)、2-one-3,4-dehydro-4,15-dihydrocostic ester(4)、7α-hydroxycostol(5)、elema-1,3,11(13)-trien-12-oic acid(6)、atractylenolid I(7)、atractylenolidⅢ(8)、atrchiterpene B(9)、olean-12-ene-3,11-dione(10)、δ-amyrione(11)。化合物1~2、5对HUVEC细胞增殖的抑制率分别为(50.5±1.1)%、(47.3±0.9)%、(45.2±1.3)%。结论化合物1为新化合物,化合物2、4~6、10~11为首次从该植物中分离得到。化合物1~2、5具有一定程度的HUVEC细胞增殖抑制活性。

三唑并嘧啶类化合物的合成及其抗心血管病活性的研究

本文作者合成了新的5，7－二甲基－1，2，4－三唑并[1,5-a]嘧啶－2－苄硫醚类（B系列）5，7－二甲基－1，2，4－三唑并[3,4-a]嘧啶－2－苄硫醚类化合物（D系列），并测定了这两类化合物在体外对85.7mmol·L^-1 K^+和10^-4mmol·L^-1 NE(nor-epinephrine）引起的血管条收缩的抑制作用。测定结果表明，B系列化 的的活性均高于D系列化合物，在苯环的对位有体积较大的疏水性基团有助于生物活性的提高，5，7－二甲基－1，2，4－三唑并[1,5-a]嘧啶－2－对溴苄硫醚表现出最好的扩张血管活性，在浓度为10^-5mol·L^-1和10^-4·L^-1时，对10^-4mmol·L^-1 NE引起的离体血管条痉挛的抑制率均为100％；对85.7mmol·L^-1 K^+引起的离体血管条痉挛的抑制率分别为47％和100％。

基于斑马鱼模型对α-倒捻子素抗血管生成活性的初步探讨

目的:研究α-倒捻子素的抗血管生成活性。方法:首先我们测定了α-倒捻子素对斑马鱼的急性毒性,然后在安全浓度条件下,采用转基因斑马鱼和野生型斑马鱼模型分别通过不同的检测方法来测定α-倒捻子素的抗血管生成活性。结果:α-倒捻子素能够抑制转基因斑马鱼节间血管的生成数目,并且呈现剂量依赖性;α-倒捻子素能够降低72 hpf野生型斑马鱼胚胎体内的碱性磷酸酶含量,呈现剂量相关性。结论:α-倒捻子素具有明显的抗血管生成活性。

肿瘤抑素Tum5对人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性以及碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的抑制作用

目的研究肿瘤抑素Tum5对人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性以及碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法取对数生长期人脐静脉血管内皮细胞分为4组:正常对照组:无任何处理的人脐静脉血管内皮细胞;rAd-GFP组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-GFP感染并培养;rAd-Tum5组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-Tum5感染并培养;rAd-Tum5+VEGF组:人脐静脉血管内皮细胞经rAd-Tum5感染后经外源性VEGF处理。通过CCK-8活性检测试剂盒、Transwell实验、Matrigel实验分别检测细胞增殖率、迁移细胞数及管腔形成情况。取雄性健康清洁级SD大鼠64只采用随机数字表法将大鼠分为:正常对照组、碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组、碱烧伤+rAd-Tum5组,每组16只,除正常对照组外其余各组建立角膜碱烧伤模型。其中正常对照组无任何处理,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组、碱烧伤+rAd-Tum5组于烧伤后分别经结膜下注射等量无菌生理盐水、rAd-GFP、rAd-Tum5病毒,记录碱烧伤后第1天、第7天、第14天角膜新生血管相对面积及浸润炎性细胞数。结果 CCK-8实验结果显示rAd-Tum5组较正常对照组、rAd-GFP组细胞增殖率降低(均为P<0.01);而rAd-Tum5+VEGF组细胞增殖率较rAdTum5组显著升高(P=0.004),rAd-Tum5+VEGF组与正常对照组和rAd-GFP组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。Transwell实验结果显示rAd-Tum5组相对于正常对照组、rAd-GFP组每个视野细胞迁移数显著降低(均为P<0.01);而rAdTum5+VEGF组相对于rAd-Tum5组显著升高(P=0.000),但其迁移能力尚未恢复到正常水平,与正常对照组和rAd-GFP组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Matrigel实验结果显示rAd-Tum5组相对于正常对照组、rAd-GFP组每个视野细胞成管数显著降低(均为P<0.01);而rAd-Tum5+VEGF组相对于rAd-Tum5组显著升高(P=0.001)。大鼠角膜碱烧伤后第1-14天,各组角膜新生血管密度及数量逐渐增高,但是碱烧伤+rAd-Tum5组第7天、第14天角膜新生血管相对面积均显著低于碱烧伤组和碱烧伤+rAd-GFP组,提示Tum5能降低角膜新生血管生长速率并减少新生血管密度,抑制大鼠碱烧伤诱导的新生血管的形成。碱烧伤后第7天、第14天,正常对照组角膜完整、细胞排列有序,无炎性细胞浸润;碱烧伤后第7天,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组上皮结构紊乱,角膜水肿,炎性细胞浸润明显,而碱烧伤+rAd-Tum5组每个视野炎性细胞浸润数较碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组明显减少,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。碱烧伤后第14天,碱烧伤组、碱烧伤+rAd-GFP组和碱烧伤+rAd-Tum5组每个视野炎性细胞浸润数较第7天显著下降,同时碱烧伤+rAd-Tum5组角膜上皮结构整齐,水肿消退,每个视野炎性细胞浸润数显著低于碱烧伤组以及碱烧伤+rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论 Tum5可能经VEGF通路抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成活性;Tum5可显著抑制碱烧伤诱导的角膜新生血管生成及炎性细胞浸润。

高山尖杉酯碱抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成

目的 了解高山尖杉酯碱 (H)对血管生成的影响 ,为进一步研究打基础。方法 于发育第 8天的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上植入明胶海绵载体 ,其中加入不同剂量的H ,计数长入载体的血管和载体内的微管密度 (MVD)。结果 在CAM上 ,长入载体边缘的血管数和MVD在 10 0ng以上组与对照组间的差别有统计学意义 (p <0 .0 1)。结论 在CAM中 ,10 μg/kg的低剂量能抑制CAM的血管生成 。

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin ,并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA ,将其克隆入pGEM TEasy克隆载体中 ;经全自动序列分析仪测序确证后 ,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450 1 ,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒 ;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1 中进行诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE鉴定 ;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得 549bp人endostastin基因 ,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白 ,此蛋白在SDS PAGE凝胶上显示出一条约 75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达 ,并具有抗血管生成活性 。

低分子多糖对肿瘤血管生长因子抑制作用的研究

目的探讨低分子多糖对肿瘤血管生长因子的抑制作用。方法采用低分子多糖点样于接种肿瘤血管生长因子的鸡胚绒毛尿囊膜上,分别50 ug、100 ug、200 ug及对照组,置37℃CO2培养箱,48 h后观察结果。结果低剂量组50 ug组肿瘤血管生长略受抑制,中剂量100 ug组肿瘤血管生长受到明显抑制,高剂量200 ug组肿瘤血管出现坏死。结论低分子多糖能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜中的肿瘤血管生长,并随剂量增加对肿瘤血管生长因子的抑制作用而增强,且具有很强的抗血管生成活性。

土党参的化学成分及其抗血管生成活性研究

目的对土党参（金钱豹Campanumoea javanica的根）的化学成分及其抗血管生成活性进行研究。方法采用多种柱色谱技术进行分离纯化,通过波谱分析鉴定化合物结构,并用斑马鱼模型评价其抗血管生成活性。结果从土党参90%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中分离得到14个化合物,分别鉴定为金钱豹苷（1）、lobetyol（2）、4E,8E,12E-三烯-10-炔-1,6,7-十四烷三醇（3）、9-（2-四氢吡喃）-8E-烯-4,6-二炔-3-壬醇（4）、9-（2-四氢吡喃）-2E,8E-二烯-4,6-二炔-1-壬醇（5）、lobetyolinin（6）、（Z）-3-己烯-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）、3,4-二羟基苯甲酸（8）、党参苷II（9）、zanthocapensol（10）、蛇葡萄素（11）、贝壳杉双芹素（12）、β-脱皮甾酮（13）、α-托可醌（14）。结论化合物1为新的聚乙炔苷,命名为金钱豹苷;化合物2~14为首次从金钱豹属植物中分离得到。化合物3和4表现出一定的抗血管生成活性。

粤蛇葡萄的化学成分及其抗血管生成活性研究

目的对粤蛇葡萄Ampelopsiscantoniensis地上部分的化学成分及其抗血管生成活性进行研究。方法采川多种托色谱技术进行分离纯化，通过波谱分析鉴定化合物结构，并用斑马龟模型筛选其抗血管生成活性。结果从粤蛇葡萄地上部分90％乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分中分离得到15个化合物，分别鉴定为粤蛇葡萄醇（1）、圆柚酮（2）、aromadendrane-4B，1013．diol（3）、脱落酸（4）、12-oxo—hardwickiicacid（5）、白桦脂酸（6）、platanicacid（7）、香草酸（8）、h黎芦醉（9）、nectandrinB（10）、nectandrinA（11）、3，5，7-三羟基色原酮（12）、5，7，3’，4‘，5’．五羟基：：氧黄酮（13）、化腆松系（14）、杨梅营（15）。结论化合物1为新的桉烷倍半萜，命名为粤蛇葡萄醇；化合物2～7、10～12为首次从蛇葡萄植r}一分离僻剑；其余化合物为首次从该植物中分离得到。化合物9、11、12表现出一定的抗斑马鱼血管生成活性。

超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究

目的提高副产物虾壳中蛋白的提取率,并探究虾壳蛋白的功能活性。方法以小龙虾虾壳为原料,在单因素的基础上,以加酶量、复合酶比例、酶解时间和超声时间为响应变量,蛋白提取率为响应值,采用响应面Box-Behnken试验设计优化超声辅助复合酶法提取小龙虾壳蛋白的最佳工艺。进一步比较复合酶解与单酶酶解制备的多肽的抗氧化活性、抗血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性和氨基酸成分组成,研究酶解虾壳蛋白多肽的功能性质。结果加酶量10200 U,复合酶比例0.65,酶解时间2.8 h,超声时间30 min,该最优条件下的蛋白质提取率为90.30%,与预测值相对误差为1.2%。与单酶酶解液相比,复合酶解液的抗氧化能力和ACE抑制能力均显著增强,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的半最大效应浓度分别为4.38 mg/mL和3.66 mg/mL,最大的ACE抑制率达(44.93±0.89)%,且具有竞争性抑制模式。氨基酸组分分析发现酶解制备的虾壳多肽中必需氨基酸和疏水性氨基酸含量丰富,分别占氨基酸总量的43.06%和33.52%,从而表现出抗氧化活性和抗ACE活性。结论该研究有效提高了虾壳蛋白的提取率,得到的虾壳多肽中富含多种必需氨基酸和疏水性氨基酸,表现出良好的抗氧化活性和ACE抑制活性。

肿瘤抑素相关肽T42对人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞的抑制作用

目的:观察大肠杆菌内表达的pTYB2-T42重组质粒经纯化后获得的肿瘤抑素相关肽T42,在体外对人脐静脉内皮细胞及肿瘤细胞的抑制作用。方法:实验于2006-06/11在哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室完成。在大肠杆菌中表达肿瘤抑素相关T42肽并用几丁质亲和层析纯化。采用四甲基偶氮唑盐比色法研究10～200mg/L肿瘤抑素相关肽T42、T19、T21、T19+T21半量联合和顺铂对人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃腺癌细胞生长的影响,采用苏木精-伊红染色检测40mg/LT42肽作用24h后对细胞形态的影响,划痕修复实验研究40mg/LT42肽和40mg/L的T19肽+T21肽半量联合分别作用24,48h后对细胞迁移的影响。结果:①四甲基偶氮唑盐试验表明10～200mg/LT42肽对人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃腺癌细胞有明显抑制作用且呈剂量依赖性,IC50分别为45mg/L和51mg/L。②40mg/LT42肽作用24h后可见人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃癌细胞单个凋亡细胞与周围细胞分离,细胞皱缩呈圆形或卵圆,深染,染色质边集。③40mg/L的T42肽单独作用24h或者48h均可明显抑制人脐静脉内皮细胞、人SGC-7901胃癌细胞的迁移(P<0.05),与40mg/L的T19肽+T21肽半量联合组比较对两种细胞的迁移能力没有显著影响(P>0.05)。结论:T42肽能抑制人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃腺癌细胞的生长及迁移,其抗肿瘤细胞作用强于T21肽,抑制内皮细胞增殖作用强于T19肽,抑制细胞增殖活性与T19肽+T21肽半量联合用药基本相同。

姜黄属植物提取物的抗侵染和抗血管生成活性

作者评价了姜黄属植物的抗肿瘤活性。

恩度+吉西他滨治疗卵巢恶性肿瘤4例报告

目前，治疗卵巢癌多选用以铂类为基础的联合化疗方案治疗，但仍存在复发及转移。恩度为重组人血管内皮抑制素，有广谱抗血管生成活性，可通过抑制血管内皮细胞迁移而抑制肿瘤新生血管生成，阻断肿瘤营养供应，从而抑制肿瘤增殖或转移。2010～2011年，我院采用恩度＋吉西他滨（GCTB）治疗卵巢恶性肿瘤患者4例，取得较好疗效。现报告如下。

3-芳基-2,3-二氢苯并呋喃类化合物的合成研究

二氢苯并呋喃类化合物在自然界分布广泛,具有极高的应用价值.其中尤为重要的是,二氢苯并呋喃类化合物是关键的药物合成中间体,本身还具有抑制肿瘤血管生成的作用,因此探索关于二氢苯并呋喃类化合物的合成方法是十分必要的.通过实施本章介绍的实验方案便捷、高效地合成得到一种3-芳基二氢苯并呋喃类化合物4,期望以化合物4为先导化合物,通过实施此方案进一步合成一系列其它3-芳基-2,3-二氢苯并呋喃类化合物,继而筛选出具有较强抗肿瘤血管生成活性的目标分子.

糖尿病黄斑水肿新型药物研究进展

糖尿病性黄斑水肿(Diabetic macular edema,DME)继发于糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR),在发达国家中是造成视力损害的主要原因之一。DME的发病机制尚不十分明确,但近年来有证据表明,多种因素在DME的发展中起作用。针对各种致病因素,新研发的药物主要围绕抗血管活性因子、抗炎症反应、基因治疗等进行,新的治疗理念将为DME的治疗翻开新篇章。本文对在I/II期DME药物临床实验中的药物作综述。