猪发育期牙胚釉原蛋白的分离纯化及其多克隆抗体的制备

目的 制备猪釉质蛋白多克隆抗体 ,为釉原蛋白的检测提供条件。方法 选择 1月龄乳猪 ,分离埋于上下颌骨内的牙胚 ,刮取牙胚表面干酪样尚未完全矿化的釉质基质 ,通过盐酸胍抽提及SephadexG_2 0 0柱层析分离纯化猪发育期牙胚釉原蛋白 ,联合免疫家兔 ,抗血清经DE_5 2纤维素纯化 ,并经ELISA测定抗体效价。结果 SDS_PAGE电泳结果发现采用SephadexG_2 0 0葡聚糖凝胶过滤能达到较为理想的釉原蛋白分离纯化效果 ,用所提纯的猪釉原蛋白免疫家兔 ,成功地制得兔抗猪釉原蛋白抗血清 ,抗血清稀释达 1∶32 0 0 0时 ,采用ELISA法仍有明显的抗原抗体反应。结论 本实验成功制备得到抗釉原蛋白多克隆抗体 ,为釉原蛋白的检测提供了条件。

抗人釉原蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备针对人釉原蛋白的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。方法:用原核表达系统表达纯化的重组人全长釉原蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,采用有限稀释法和间接酶联免疫吸附测定法筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠体内诱导制备腹水,通过饱和硫酸铵沉淀法和蛋白G亲和层析柱纯化抗体。结果:筛选到3株能稳定分泌抗人釉原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为H10G1、H3G1、G5H3。腹水单克隆抗体效价分别为1∶243 000、1∶729 000、1∶729 000,纯化后单克隆抗体效价为1∶81 000、1∶243 000、1∶729 000。3株单克隆抗体抗原表位分析显示均识别人釉原蛋白45～149位的氨基酸序列。结论:成功制备出针对人釉原蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究探讨釉原蛋白在牙根发育及牙周再生中的功能奠定了基础。

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol·L-1咪唑洗脱和0.01 mol·L-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a(+)表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到一条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。

凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白单克隆抗体的制备及其过敏原表位分析

目的制备凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白的单克隆抗体(mAb),运用它们和虾过敏患者血清分析凡纳滨对虾原肌球蛋白的过敏原表位。方法纯化的凡纳滨对虾原肌球蛋白免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和Western blot筛选并建立稳定分泌抗原肌球蛋白抗体的杂交瘤细胞株;腹水型mAbs经硫酸铵沉淀、Protein G亲和层析纯化;叠加ELISA分析mAbs的抗原结合表位;虾过敏患者血清lgE与mAbs的抑制Western blot和间接竞争ELISA分析原肌球蛋白的过敏原表位。结果共筛选出5株mAbs,它们之间叠加ELISA的叠加值均高于40%;其中B5和A5能显著抑制虾过敏患者血清IgE与原肌球蛋白的结合,抑制率分别为58.1%和48.6%,同时也能抑制66.7%和44.3%的血清IgE与虾蛋白粗提液反应。结论成功制备了5株分别结合原肌球蛋白不同抗原表位的单克隆抗体,其中B5和A5能结合其过敏原表位。

胃蛋白酶原与胃癌单克隆抗体联合检测在胃癌前病变诊断中的应用

目的:探讨血清胃蛋白酶原(pepsinogen,P G)与胃癌单克隆抗体(MG-Antigen7-Ag,MG7-Ag)联合检测在胃癌前病变诊断中的应用价值.方法:对因上消化道症状就诊于天津市中医药研究院附属医院,并行胃镜和病理检查的102例患者,依据结果分为胃癌前病变组65例和胃良性病变组37例,另取体检中心健康体检者30例作为正常对照组.对3组人员进行胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)及PGR和胃癌单克隆抗体(MG7-Ag)检测.得出结果后结合胃镜及病理综合分析两项血清学指标与胃黏膜状态的相关性.结果:与正常对照组和胃良性病变组比较,胃癌前病变组血清PGⅠ、PGR水平均明显降低(P<0.05),而PGⅡ和MG7-Ag水平明显增高(P<0.05).PG、MG7-Ag联合检测胃癌前病变的灵敏度为92.3%,高于单项肿瘤标志物检测的敏感度;其特异性为90.0%,较单项指标无明显差别.结论:PG与MG7-Ag联合检测对胃癌前病变的诊断敏感性高,特异性佳,可以作为胃癌前病变筛查的良好指标,值得向临床进一步推广.

人Ⅳ型胶原蛋白提取及其单克隆抗体的制备与鉴定

从人胎盘提取Ⅳ型胶原（ＣＯＬⅣ）为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞融合，获得３株分泌抗ＣＯＬⅣ单克隆抗体的杂交瘤细胞。间接ＥＬＩＳＡ测定表明，３株ＭｃＡｂ与ＣＯＬⅣ有较强的反应，而与其它３种胶原及４种测试蛋白均无交叉反应。其中２株ＭｃＡｂ的亲和力都在１０（１１）以上。

虾原肌球蛋白及其IgE单克隆抗体建立I型过敏反应体内外模型

目的利用虾原肌球蛋白及其Ig E单克隆抗体建立I型过敏反应体内外模型。方法采用等电点沉淀法制备刀额新对虾原肌球蛋白,利用杂交瘤技术制备抗虾原肌球蛋白Ig E单克隆抗体。建立虾原肌球蛋白攻击Ig E单抗致敏的RBL-2H3细胞模型,测定β-氨基己糖苷酶释放量。利用虾原肌球蛋白及其Ig E单抗建立被动全身过敏反应小鼠模型,监测抗原攻击后30 min内肛温的变化。结果 Ig E单抗致敏的RBL-2H3细胞在虾原肌球蛋白攻击后发生脱颗粒,β-氨基己糖苷酶释放量明显增加。虾原肌球蛋白及其Ig E单抗诱导了小鼠被动全身过敏反应,抗原攻击后小鼠肛温平均下降约1.44℃。结论虾原肌球蛋白及其Ig E单克隆抗体成功建立了I型过敏反应体内外模型。

血管生成素样蛋白2纤维蛋白原样功能域多克隆抗体制备及分析

目的:克隆血管生成素样蛋白2(angiopoietin like protein2,ANGPTL2)cDNA;构建ANGPTL2纤维蛋白原样功能域原核表达载体;表达得到ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白;制备针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2的功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。方法:利用RT-PCR方法从肾脏总RNA中扩增ANGPTL2全长cDNA;以其为模板扩增编码ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的cDNA片段,并进而将其克隆至原核表达载体pET-15b上,构建成ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的原核表达载体pET-ANGPTL2;将pET-ANGPTL2导入BL21(DE3)菌内,通过IPTG诱导表达重组蛋白;利用重组蛋白5'端带有Histag的特点,采用含Ni的树脂进行亲和吸附纯化,获取高纯度的重组蛋白;将重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗ANGPTL2多克隆抗体;利用ELISA法测定和免疫组化分析对此多抗的效价和特异性进行分析。结果:取得了带有完整阅读框的ANGPTL2全长cDNA;构建成与预先设计完全一致的原核表达载体pET-ANGPTL2;成功地在大肠杆菌中进行了ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白的表达,纯化获取纯度很高的重组蛋白;经免疫兔获取高效价的针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体;ELISA检测和免疫组化分析表明,此抗体不仅具有很高的效价,而且具有很好的特异性。结论:我们成功地克隆了ANGPTL2cDNA,构建了其原核表达载体,进行了原核表达,成功取得高纯度的重组蛋白,并得到了高效价、高特异性针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。

禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析

以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原，免疫BALB／c小鼠，细胞融合后，经间接ELISA和血凝抑制试验（HI）筛选，获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明，8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达113．2×10^3～1：5．1×10^4，其中2株HI效价达2^12。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝，与减蛋综合征（EDS-76）病毒、传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）均不反应。亚类鉴定证实，除1C7单抗为IgG2b外，其他7株均为IgG1亚类。Western blotting试验分析初步表明。8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原，其中3株针对核蛋白（NP）．2株针对基质蛋白M1，2株针对血凝紊HA／HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致，其中1株朱明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。

抗人纤维蛋白(原)及降解产物单克隆抗体制备及特性的探讨

本文报告了抗人纤维蛋白(原)及降解产物单克隆抗体的研制,并对其特异性、结合力、滴度等特性进行了探讨,为研究纤维蛋白(原)及降解产物提供了多样化、专一性的抗体,也为临床许多与其有关疾病的特异性诊断治疗提供了先进手段。

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备及应用

目的 :制备抗胰蛋白酶原激活肽 (TAP)单克隆抗体 (TAPmAb) ,并建立敏感、特异的TAP免疫检测方法。方法 :将人工合成的TAP与血蓝蛋白 (KLH)交联制成免疫原 ,免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 / 0细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,经多次克隆化 ,获得稳定分泌TAPmAb的杂交瘤细胞株 ,并进行鉴定 ,进而建立检测TAP的ELSIA竞争法。结果 :获得10株能稳定分泌TAPmAb的杂交瘤细胞株 ,除 1株为IgG1外 ,余 9株均为IgM类 ;效价达 1∶10 5～ 1∶10 6;与BSA、人白蛋白、胰蛋白酶原、淀粉酶均无交叉反应 ,中和抑制试验表明培养上清、腹水中的抗体能明显被TAP中和。建立了检测TAP的ELISA竞争法 ,灵敏度为 0 .6 9μg/L ,批内变异系数为 9.10 % ,批间变异系数为 10 .33%。用该法测定急性胰腺炎组患者及对照组患者TAP含量分别为 5 7.35 μg/L及 9.30 μg/L (P <0 .0 1)。结论 :成功制备抗TAPmAb ,并建立了敏感的ELISA竞争法。

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗胰蛋白酶原激活肽(TAP)单克隆抗体(TAP McAb),并进行初步鉴定.方法将人工合成的TAP与血蓝蛋白(KLH)交联作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合,有限稀释法筛选出能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体进行鉴定.结果细胞融合率85.03%,经4次克隆化后获得10株能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株,经免疫球蛋白亚类鉴定,除1株为IgG1外,其余9株均为IgM类;染色体数目为92～101条;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测杂交瘤细胞培养上清效价为1:20～1:160,腹水效价为1:3 200 ～1:25 600;特异性试验表明,抗TAP单克隆抗体与牛血清白蛋白(BSA)、人白蛋白、胰蛋白酶、淀粉酶均无交叉反应;中和抑制试验表明,培养上清及腹水中的抗体能明显被合成多肽TAP及为急性胰腺炎患者尿液所中和;对其中5株细胞株进行相对亲和力分析结果表明,2C3>8C6>6H7>6F7>8B10.结论成功制备了抗TAP单克隆抗体,为建立敏感、特异的TAP免疫检测方法奠定了基础.

单克隆抗体检测纤维蛋白原降解产物—D碎片及其临床研究

纤维蛋白原(FG)经凝血酶作用形成纤维蛋白(Fb),经纤溶酶进一步作用形成FG/Fb降解产物(统称FDP/fdp)。其中FG及未交链Fb降解产物包括X、Y、D、E碎片;交链纤维蛋白降解产物包括D-dimer及DD/E复合物等。

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备及研究

研究表明 ,血和尿中的胰蛋白酶原激活肽 (TAP)含量 ,能够特异地反映胰蛋白酶的肠外激活和胰腺坏死的程度。这对及时、准确地诊断急性胰腺炎有重要的临床意义。本研究用KLH连接的TAP作免疫原 ,共建立了 4株抗TAP的单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,均属IgG1亚类。单克隆抗体效价达 1:5× 10 5至 1:1× 10 7。效价高 ,稳定性好 ,特异性强 ,与胰蛋白酶原无交叉反应。为建立更敏感、更特异的TAP免疫检测方法 ,并用于探讨胰蛋白酶异位激活的致病机制的研究 ,以及全身性炎症反应在局部损伤作用的研究创造了条件。

兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体的制备

为制备兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体,将纯化LGALS1蛋白作为抗原,联合弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂免疫新西兰大白兔,经过3次免疫后采集兔血清,采用间接ELISA测定抗血清效价,Western blot检测分析抗体特异性,IFA检测抗体应用效果。结果:血清效价为1∶102 400,Western blot检测可见特异性条带,IFA检测显示细胞质呈特异绿色荧光。结论:试验成功制备了兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体,抗体特异性好,效价高。

抗CCL20单克隆抗体对血清淀粉样蛋白A相关的结节病中促炎性细胞因子的抑制作用

目的探讨抗CCL20单克隆抗体是否可抑制高水平血清淀粉样蛋白A(SAA)相关的结节病外周血单个核细胞(PBMC)中促炎性细胞因子的表达。方法提取健康人和结节病患者的PBMC,并进行分组。除空白对照组(正常人PBMC)和结节病PBMC对照组(患者PBMC)外,另将结节病组PBMC中分别加入SAA、SAA+抗CCL20单克隆抗体、SAA+NF-κB抑制剂BAY11-7082或地塞米松,经培养48 h后收集各组细胞,分别作为PBMC+SAA刺激组、PBMC+SAA+NF-κB抑制剂BAY11-7082组、PBMC+SAA+抗CCL20单抗组、PBMC+地塞米松干预组,使用ELISA分别测定各组细胞上清液中细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、CCL20和TGF-β1的表达,使用RT-PCR测定各组细胞中CCR6、IL-17、ROR-γt和Foxp3的mRNA表达水平,使用Western blot检测各组细胞中p-NF-κB和NF-κB蛋白的表达水平。结果PBMC+SAA+抗CCL20单抗组与PBMC+SAA组相比,细胞上清液中的IL-17A、IL-23和IL-6的水平显著降低(P<0.01),而TGF-β1的含量显著升高(P<0.01)。PBMC+SAA+抗CCL20单抗组相较于PBMC+SAA组,细胞中CCR6、IL-17A、ROR-γtmRNA水平显著降低(P<0.01),而Foxp3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。PBMC+SAA+抗CCL20单抗组中p-NF-κB蛋白表达水平较PBMC+SAA组明显降低(P<0.01)。结论抗CCL20单克隆抗体可抑制高水平SAA相关的结节病PBMC中促炎性细胞因子的表达。

用合成多肽制备抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的研究

目的建立以合成的小分子肽胰蛋白酶原激活肽制备单克隆抗体(mAb)的技术路线。方法以合成多肽TAP与载体KLH交联的偶联物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立能稳定分泌抗TAPmAb的杂交瘤细胞株。结果共获得10株能稳定分泌TAPmAb的杂交瘤细胞株,经稳定性试验,对其分泌的mAb进行效价测定、中和抑制试验、特异性鉴定,均表明所制备的杂交瘤细胞株稳定性好,其所分泌的mAb效价高、特异性好。结论利用合成多肽TAP成功制备了抗TAP单克隆抗体。

AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:表达腺相关病毒(AAV)9型衣壳蛋白VP,制备抗VP蛋白的多克隆抗体。方法:使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP,同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白VP表达,亲和层析法纯化VP蛋白,将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔,3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用,ELISA检测所得抗体的效价。结果:成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒,在大肠杆菌BL21中,IPTG可诱导VP蛋白表达。亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。结论:成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白,并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析,为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。

拟南芥ERA-1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体p ET28a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,发现表达的目的蛋白位于包涵体中,大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化,获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔,获得抗血清。用重组蛋白亲和纯化抗血清中的ERA-1多克隆抗体。利用野生型拟南芥、ERA-1敲除突变系和ERA-1过表达系的叶片总蛋白进行免疫印迹试验,检测ERA-1多克隆抗体的特异性,发现纯化后的ERA-1多克隆抗体(1∶1 000体积比稀释)能特异地检测到拟南芥中的ERA-1蛋白。本试验成功制备了ERA-1蛋白的多克隆抗体,可以用于今后对ERA-1基因功能的研究。