VEGFR-2/KDR三区的载体构建、表达及胃癌患者抗-KDR抗体的检测

目的扩增人血管内皮细胞生长因子受体-2/激酶插入受体(VEGFR-2/KDR)三区基因,构建表达载体,在大肠埃希菌中表达,获得纯化蛋白。检测胃癌术前患者外周血中抗-KDR抗体水平,为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定基础。方法从人血管内皮细胞株ECV304提取总RNA,逆转录后,聚合酶链反应(PCR)扩增KDR胞外段三区基因,连接到pMD18-T载体测序;酶切后将目的基因插入原核表达载体pET28a(+)构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠埃希菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达菌株BL21(DE3),异丙基-β-D硫化半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni2+-NTA树脂纯化、复性;用获得的蛋白包被酶联免疫吸附试验(ELISA)板,用ELISA检测32例胃癌患者和35名健康对照者外周血抗-KDR抗体水平。结果构建了表达载体pET28a(+)-KDR3,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为16 000,重组蛋白以包涵体形式存在。胃癌患者外周血中抗-KDR抗体水平显著高于健康对照组(P<0.01)。结论VEGFR-2/KDR三区基因成功克隆到表达质粒内并表达。为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定了基础,及可能为胃癌的血清学诊断提供新的方法。