水稻乙酰乳酸合酶Ala179Val突变赋予ALS抑制剂类除草剂广谱抗性

为了鉴定新型水稻突变体ALS179对乙酰乳酸合酶(ALS,acetolactate synthase)抑制剂类除草剂的抗性,本研究以野生型水稻华航31(HH31)、耐咪唑啉酮除草剂水稻ALS627突变体和甲基磺酸乙酯(EMS,ethyl methyl sulfone)诱变的新型水稻突变体ALS179为试验材料,通过不同浓度下的4类乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂包衣浸种和苗期喷施处理,进一步测定表型及相关酶活性指标来探究突变体ALS179的抗性。结果表明,经过除草剂包衣浸种以及苗期喷施处理后,突变体ALS179对苯磺隆、咪唑乙烟酸、双草醚及啶磺草胺具有不同程度的抗性,且乙酰乳酸合酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性随除草剂浓度的升高呈下降趋势。除了20×,30×的咪唑乙烟酸处理条件下过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性低于野生型HH31外,其他处理条件下ALS179的乙酰乳酸合酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性均高于野生型HH31。因此,本研究发现Ala179Val突变赋予了对ALS抑制剂类除草剂的广谱抗性,为后续ALS类除草剂广谱抗性水稻品系的培育提供遗传种质资源。

ALS以及ALS抑制剂类除草剂的研究进展

使用除草剂是根除作物田里杂草的有效方法,其中以乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase, ALS)为靶标的除草剂在杂草防治方面有很好的应用价值。本文对乙酰乳酸合成酶的结构、ALS抑制剂类除草剂种类、抗除草剂植物抗性机理、抗ALS抑制剂类除草剂作物的研究进展进行了综合概括。

超声辅助提取-液相色谱-串联质谱法同时测定油料作物中6种新型乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂残留

将超声辅助提取与液相色谱-质谱联用技术相结合,建立了油料作物中6种新型乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂(甲基二磺隆、氯吡嘧磺、双草醚、嘧草醚、嘧苯胺磺隆和乙氧嘧磺隆)的痕量多残留检测技术。比较了超声辅助提取和QuEChERS提取2种方法对6种除草剂的提取回收率,并根据净化效果和吸附作用对十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、弗罗里硅土(Florisil)和增强型基质去除吸附剂(EMR) 5种吸附材料进行优化。结果表明,超声辅助提取可使6种化合物的提取回收率在90. 0%以上,EMR对6种化合物的吸附作用较小,且可有效去除油脂干扰,减小基质效应。6种除草剂在0. 05～500. 0μg/L范围内具有良好的线性,相关系数均大于0. 998 4。该方法检出限和定量限分别为0. 08～0. 8μg/kg和0. 25～2. 5μg/kg。6种化合物在油菜籽、大豆、花生米和葵花籽4种基质中3个加标水平下的加标回收率为70. 7%～103. 8%,相对标准偏差为0. 8%～9. 2%,可应用于油料作物中6种ALS抑制剂类除草剂的同时测定。

油菜抗除草剂新种质PN19的交互抗性鉴定及其抗性基因的表达研究

鉴定抗除草剂油菜种质对不同种类除草剂的交互抗性,获得可安全交替使用的其他类型除草剂,可延长抗性品种使用时间。本研究以油菜抗SU类除草剂新种质PN19及转抗性基因的拟南芥和烟草为材料,在3-5叶期喷施不同浓度梯度的五大类ALS抑制类除草剂(SU、IMI、TP、PB和SCT类),通过抗性鉴定以确定PN19对各类除草剂的交互抗性。结果表明:SU和SCT类交互抗性最强,IMI和TP类其次,PB类最低。转基因植株除草剂抗性评价及烟草ALS酶体外活性分析表明,五类除草剂交互抗性功能源于靶标ALS酶对各除草剂敏感性下降。且五类除草剂处理后PN19抗性基因较野生型表达上调。本研究为田间ALS类除草剂混合使用进行杂草防控提供了可能性。

抗除草剂作物的创制与发展

从1996年开始推广抗除草剂作物以来,转基因抗除草剂作物迅速发展,出现了一系列新的抗除草剂作物,对于解决农业生产中的草害问题发挥了重要的作用。本文介绍了抗除草剂作物的发展历程和创制方法。在今后的发展中,农药公司应与种子公司紧密合作,致力于多抗性作物的开发。

两株抗乙酰羟酸合酶类除草剂克雷伯氏菌的分离及其AHAS基因ilvIH的克隆

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.本文从长期使用磺酰脲类除草剂的农田土壤中分离到2株抗性细菌HR9和HR11,根据其表型特征、生理生化特性和16SrDNA序列系统发育分析,初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.).菌株HR9和HR11对甲磺隆的最高耐受浓度分别达到9600μmol/L和8200μmol/L,且对各种乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性.利用PCR技术从HR9、HR11和实验室保存的一株除草剂敏感型克雷伯氏菌LB-2的总DNA中克隆到编码AHAS的基因ilvIH,其中ilvI编码大亚基即催化亚基,ilvH编码小亚基即调节亚基.比对结果表明,菌株HR11与菌株HR9的ilvI有6个位点的氨基酸存在差异,HR9、HR11与LB-2的ilvI各有20和16个位点的氨基酸存在差异.

EMS诱变的水稻不同位点突变体对ALS抑制剂类除草剂抗性差异

稻田杂草严重威胁水稻生长,培育抗除草剂水稻新品种,是高效解决稻田杂草危害的重要途径之一。本研究利用甲基磺酸乙酯(EMS)对华占水稻进行化学诱变,创建突变体,利用乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂甲咪唑烟酸(20 g/hm 2,有效成分)对突变体进行筛选,获得抗甲咪唑烟酸突变体材料,并对上述突变体的OsALS基因序列进行分析,明确其突变类型。最后对不同突变类型对甲氧咪草烟和甲基二磺隆的交互抗性进行分析。结果表明,华占水稻经EMS诱变和甲咪唑烟酸筛选后共获得11株抗甲咪唑烟酸突变体材料,其突变类型为Pro171Leu、Ser627Cys、Ser627Asn和Gly628Glu 4种。其中,Ser627Cys为首次发现的突变类型。4种突变类型对甲咪唑烟酸的抗性水平存在一定的差异,Ser627Asn、Ser627Cys、Pro171Leu、Gly628Glu突变类型的抗性指数分别为8.71、5.16、3.28和3.69。4种突变类型对甲氧咪草烟和甲基二磺隆的抗性亦存在显著差异。其中,Ser627Asn突变类型对甲氧咪草烟的抗性最高,抗性指数为20.57,Gly628Glu对甲基二磺隆抗性最高,抗性指数为5.11。综上,本研究通过EMS诱变获得了4种抗ALS抑制剂类除草剂的华占水稻突变类型,并鉴定了其对甲咪唑烟酸的抗性差异及对甲氧咪草烟和甲基二磺隆的交互抗性,为进一步的抗除草剂水稻品种培育和除草剂轮换使用提供依据。

杂草对ALS抑制剂的抗性及机理

当今,世界上有关杂草对除草剂抗性的文章已有280篇以上,其中有关对乙酰乳酸合成酶(即ALS)抑制剂抗性的报道亦达80篇之多,为各类除草剂之首.其已成为作物中杂草防除的一个重大问题.在日本,此问题在水稻中尤为突出,为此,必须充分了解其抗性机理,才能有效地克服和延缓抗性的发生.

稻麦轮作区日本看麦娘抗药性水平测定及高效除草剂筛选

以兴化市钓鱼镇省长示范方麦田采集的日本看麦娘种子与笔者保存的敏感型日本看麦娘为材料,采用室内整株生物测定与大田除草剂配方试验相结合的研究方法,分析其对ALS类除草剂——啶磺草胺与甲基二磺隆、ACCase抑制剂类除草剂——炔草酯和精唑禾草灵的抗药性情况,并筛选出可有效治理麦田杂草的除草剂配方。结果表明,采集的日本看麦娘种群对ACCase抑制剂类除草剂炔草酯和精唑禾草灵产生了中等水平抗药性,抗性指数分别为6.00和5.17,但该种群未对供试的ALS抑制剂类除草剂产生抗药性。田间配方筛选试验结果表明,在供试配方处理中,7.5%啶磺草胺141 g/hm^2+40%唑草酮30 g/hm^2混用能够有效防除日本看麦娘,药后60 d的株防效和干质量防效分别为91.6%、93.9%。相对于不除草对照,不同处理的产量都显著提高,尤其是7.5%啶磺草胺+40%唑草酮处理,产量达到了7 210.05 kg/hm^2,与人工除草处理区基本一致。

嘧啶(硫)醚类除草剂的非线性QSAR研究

在进行分子力学和量子化学计算的基础上 ,采用人工神经网络方法对 4 0种嘧啶 (硫 )醚类除草剂进行了非线性 QSAR研究 ,得出了影响它们除草活性的重要特征指标 ,结合量子化学研究结果 。

单取代磺酰脲类超高效创制除草剂——单嘧磺隆与单嘧磺酯

ALS酶是植物体内所特有的一种靶酶，在温血动物中不存在。20世纪80年代初美国杜邦公司发现磺酰脲类ALS酶抑制剂以来，磺酰脲类超高效除草剂成为农药创制史上的一个里程碑。它的超低用量大大改善了对环境的影响，而且对温血动物几乎无毒，迅速在国际上欣起一股研发热潮。南开大学元素有机化学研究所李正名院士课题组，自上世纪90年代初开始对磺酰脲类除草剂进行了深入和系统的研究，合成了近600个磺酰脲类新化合物，

单取代磺酰脲类超高效创制除草剂——单嘧磺隆与单嘧磺酯

ALS酶是植物体内所特有的一种靶酶，在温血动物中不存在。20世纪80年代初美国杜邦公司发现磺酰脲类ALS酶抑制剂以来，磺酰脲类超高效除草剂成为农药创制史上的一个里程碑。它的超低用量大大改善了对环境的影响，而且对温血动物几乎无毒，迅速在国际上欣起一股研发热潮。南开大学元素有机化学研究所李正名院士课题组，自上世纪90年代初开始对磺酰脲类除草剂进行了深入和系统的研究，合成了近600个磺酰脲类新化合物，首次发现单取代的磺酰脲分子同样具有很高的除草活．性，总结了磺酰脲活性结构三要素，从而部分修正和发展了国际上公认的磺酰脲构效关系理论，获得了系列中国发明专利的授权并相继开发和工程化了单嘧磺隆和单嘧磺酯两个创制农药新品种及其制剂，其中单嘧磺隆是我国第一个具有自主知识产权的创制除草剂，突破了国际上已商品化的磺酰脲类超高效除草剂必须含有双取代杂环的经典结构要求。

可广泛使用的新型磺酰脲类除草剂——噻吩磺隆

噻吩磺隆（Thifensulfuronmethy）是一种新型磺酰脲类除草剂,它属于侧链氨基酸合成抑制剂,可有效防除禾谷类作物田间阔叶杂草,目前使用较为广泛,且该化合物原药在国内已经正式登记保护期,部分制剂产品在国内已经有六年以上的应用实践,就登记而言噻吩磺隆均有得天独厚的优势.

拜耳推出Ignite除草剂

拜耳作物科学公司的Ignite 280 SL除草剂，适用于所有的作物，能防控120多种阔叶杂草和牧草，包括顽固杂草、ALS抑制剂和抗草甘膦杂草等。

广东省稻菜轮作区中牛筋草对十种除草剂的抗性水平及靶基因序列分析

为明确广东省稻菜轮作区中牛筋草对10种常用除草剂的抗性水平及抗性分子机制,采用整株生物测定法测定广东省稻菜轮作区内8个牛筋草种群P1~P8对草甘膦、草铵膦和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACCase)抑制剂类等10种除草剂的抗性水平,并进一步分析P1和P8种群相关靶标酶基因5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和ACCase的部分功能区序列特征。结果显示,牛筋草P1~P8种群对草甘膦抗性指数为敏感种群的5.9倍~17.7倍,其中P8种群对草甘膦的抗性水平最高;8个种群对草铵膦也产生了不同程度的抗性,抗性指数为敏感种群的2.3倍~14.2倍,其中P1种群抗性最高。牛筋草P1和P8种群均对ACCase抑制剂类除草剂精喹禾灵、氰氟草酯和噁唑酰草胺产生了交互抗性;P1种群ACCase基因在第2041位氨基酸处发生突变,该突变在牛筋草种群中首次发现;而P8种群ACCase基因则在第2027位氨基酸处发生突变。牛筋草高抗种群P1和P8及敏感种群对乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)、对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(4-hy-droxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)抑制剂类除草剂以及合成激素类除草剂均不敏感。尽管ACCase抑制剂类除草剂烯草酮尚能有效防控部分牛筋草种群,但从长远来看,有必要加强杂草绿色综合防控技术研究与应用,以延缓抗性杂草种群的进化和蔓延。

抗甲磺隆假单胞菌的分离及其乙酰乳酸合酶的大小亚基ilvIH基因的克隆和表达

乙酰乳酸合酶(也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS)是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标。【目的】获得抗甲磺隆的乙酰乳酸合酶基因,构建其表达载体,并分析基因中的位点突变与乙酰乳酸合酶对磺酰脲类除草剂抗性产生原因。【方法】从长期使用甲磺隆的土壤中分离到1株抗甲磺隆的菌株Lm10,利用PCR技术从Lm10总DNA中克隆到乙酰乳酸合酶的大小亚基基因ilvIH,对ilvIH氨基酸序列进行比对分析。分别将ilvI和ilvH分别连接到表达载体pET29a(+)多克隆位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli)获得转化子BL21(pET-I)和BL21(pET-H),并诱导表达。【结果】菌株Lm10鉴定为假单孢菌(Pseudomonas sp.),对甲磺隆的最高耐受浓度达到14000μmol//L,且对各种乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性。Lm10与甲磺隆敏感菌株KT2440的小亚基氨基酸序列完全相同,而大亚基有6个氨基酸位点发生变异。转化子在IPTG诱导下,乙酰乳酸合酶的大小亚基的蛋白成功表达,粗酶液酶活试验结果表明Lm10的ilvI基因表达的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性。【结论】发现菌株Lm10的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性,抗甲磺隆菌株Lm10与敏感菌株KT2440的ilvI有6个氨基酸位点差异,这些位点突变可能是乙酰乳酸合酶对甲磺隆抗性产生的原因。

乙酰羟酸合成酶同工酶基因ilvBN、ilvGM和ilvIH的表达及对除草剂抗性的比较

乙酰羟酸合成酶(AHAS)是磺酰脲类和咪唑啉酮类等AHAS抑制剂类除草剂的作用靶标。获得抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值。本研究从抗甲磺隆菌株Klebsiella sp.HR11和甲磺隆敏感菌株Klebsiella pneumoniae MGH 78578中分别克隆到AHAS三种同工酶基因ilvBN、ilvGM和ilvIH。抗性菌株和敏感菌株AHAS三种同工酶基因在氨基酸水平上差异位点主要集中在ilvBN和ilvGM的大亚基上。将2株菌的ilvBN、ilvGM和ilvIH分别构建到表达载体pET29a(+)中,在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,测得只有含菌株HR11 ilvBN和ilvGM的转化子细胞破碎液AHAS对各类AHAS抑制剂类除草剂具有较强的抗性,而含菌株HR11 ilvIH和菌株MGH78578 ilvBN、ilvGM和ilvIH的转化子细胞破碎液AHAS对各类AHAS抑制剂类除草剂敏感。

全球杂草抗性发展现状和抗性治理策略

1全球杂草抗性发展现状 1956年,第一例抗性杂草野胡萝卜(Daucuscarota L.)被发现;1954-1960年,约有17例抗性杂草出现;1965—1980年,抗性杂草达到41例(主要是三嗪类抗性);1980-1995年,出现191例抗性杂草,主要ACCase和ALS抑制剂除草剂抗性增加;2018年全球抗性杂草达495例(生物型),涉及杂草255种(其中双子叶杂草148种,单子叶107种)。杂草对26种已知的作用位点中的23种产生了抗性,抗性杂草在70个国家的92种作物都有报道。从1992年首次报道杂草抗性至2018年,中国已有44例抗性报道。

新型除草剂丙酯草醚的作用机理

采用常规的室内生测和生化方法,开展新型除草剂丙酯草醚的作用机理研究。试验结果表明:同时添加5mg/L 浓度的三种支链氨基酸即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸能完全恢复丙酯草醚对高粱茎的生长抑制作用,而添加相同浓度的单一支链氨基酸只能部分消除其抑制作用。离体条件下,丙酯草醚 IC_(50)>100mg/L,而双草醚 IC_(50)值为10^(-5)～10^(-4)mg/L,说明丙酯草醚对离体 ALS 没有抑制作用;活体条件下,丙酯草醚对 ALS 有一定的抑制作用,且随着处理时间的延长,酶活力降低,对 ALS 的抑制作用增加。因此,丙酯草醚使植物体内必需的支链氨基酸合成受阻,仍然属于 ALS 抑制剂,但其作用方式不同于磺酰脲类和嘧啶水杨酸类除草剂等典型的 ALS 抑制剂,它类似于前体农药,即在植物体内通过代谢活化来发挥作用。

生物技术与作物品种改良研究进展

现代生物技术是70年代初在重组DNA技术、细胞培养技术及生物反正技术等深入发展的基础上产生的一门新兴学科。一般认为,生物技术包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等四个方面。在农业上利用基因工程技术可以把重组的外源DNA片段转入作物细胞和组织,并使其在受体细胞或再生的植株中稳定地保留和表达,最后通过有性或无性繁殖传递给后代。这一技术打破了物种之间的生殖隔离,可以使遗传基因在不同种属之间。