注射抗CD20单克隆抗体后发生荨麻疹性血管炎一例

患者,女,61岁。全身皮肤泛发红斑1天。起病前7天因“红斑型天疱疮”应用抗CD20单克隆抗体治疗。用药后躯干、四肢泛发水肿性红斑。结合组织病理诊断为荨麻疹性血管炎。给予甲泼尼龙、氯雷他定等治疗,4天后患者皮疹逐渐消退,原有红斑部位可见色素沉着斑。随访8个月,皮疹未复发。

抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性测定方法的建立

目的建立基于报告基因的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法。方法以WIL2-S细胞系作为靶细胞,以Jurkat-NF-κB-Luc转基因细胞系作为效应细胞,对抗体的量效范围、孵育时间、诱导时间、效靶比及细胞接种密度进行优化,构建可用于测定抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性的报告基因法。依据ICHQ2的指导原则对方法进行全面验证,包括专属性、准确性、精密度、线性、稳定性。结果成功建立了具有量效关系的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法的抗体起始浓度为500 ng/mL,稀释倍数为1∶4,共计8个浓度点(500,125,31.25,7.81,1.95,0.49,0.12,0.031 ng/mL),效靶比为4∶1,诱导时间为4 h。本方法具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经测定,相对效价分别为59.63%±4.57%,75.54%±4.05%,99.98%±9.63%,123.90%±5.54%和142.51%±12.82%;对应的回收率分别为93.17%±7.15%,94.42%±5.06%,99.98%±9.63%,99.12%±4.43%以及91.21%±8.21%,CV分别为7.67%,5.35%,9.63%,4.47%和9.00%,上述结果的变异系数CV值均<10%;实测效价与理论效价线性回归分析相关系数R^(2)=0.9823,线性良好;本研究建立的方法可以敏感检测出抗体结构变化对生物活性的影响,对双特异性抗体的稳定性检测有一定的指导意义。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性。

抗CD3/CD28单克隆抗体联合PHA对T淋巴细胞活化和增殖的影响

目的探讨抗人CD3/CD28单克隆抗体联合植物血凝素(PHA)对人外周血T淋巴细胞活化增殖的影响。方法通过Ficoll密度梯度离心法分离健康成人外周血单核细胞后,用CD3免疫磁珠分选T淋巴细胞,抗CD3/CD28单抗、PHA及重组人白介素-2(recombinant human IL-2,rhIL-2)刺激T淋巴细胞。用CCK-8试剂盒(CCK-8 cell counting kit)检测细胞增殖情况,ELISA测定细胞上清液干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的含量。结果CCK-8结果显示在增殖3 d时,CD3/CD28+PHA组A450 nm值与PHA组、IL-2组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05);比较各组在6、9、12 d的增殖情况,CD3/CD28+PHA组的A450 nm值与其他各组差异均有统计学意义(P<0.05)。刺激3 d各组分泌的IFN-γ质量浓度是最高的。刺激9 d时,CD3/CD28+PHA组、CD3/CD28组、PHA组上清液中IFN-γ浓度分别为(235.27±27.80)、(189.23±24.79)和(124.66±3.39)pg/mL,CD3/CD28+PHA组上清液中IFN-γ的质量浓度高于其余2组(P<0.05)。结论抗CD3/CD28单抗联合PHA比单用抗CD3/CD28单抗、PHA或rhIL-2能更好地激活T细胞及持久地促使T细胞增殖。

CD3和CD28单克隆抗体联合作用对CIK细胞及其亚群增殖及功能的影响

目的:探讨CD3和CD28单克隆抗体联合作用对细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞及其亚群增殖及功能的影响。方法:采集2014年6月至2015年6月在郑州大学第一附属医院接受生物细胞治疗的20例肿瘤患者(肾癌6例,肺癌5例,肝癌、乳腺癌和恶性黑素瘤各2例,胆囊癌、淋巴瘤和卵巢癌各1例)的外周血,每例外周血均分为4组(对照组,单用CD3单抗组,单用CD28单抗组,CD3和CD28单抗联合作用组)进行CIK细胞的诱导培养。用CFSE染色检测CIK细胞的增殖能力;ELISA检测CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平;磁珠分选CIK细胞亚群CD4+、CD8+和CD56+细胞,然后用ELISA检测对CIK细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2能力的影响。结果:CD3/CD28单抗联合作用(PI=59.35)对CIK细胞的增殖能力的影响与单独使用CD3单抗(PI=64.4)相比效果并不明显,但是可以刺激CIK细胞分泌较高水平的IFN-γ和TNF-α[IFN-γ:(384.6±263.1)vs(201.5±271.5)pg/ml,P=0.0361;TNF-α:(4.795±1.251)vs(2.835±0.443)pg/ml,P=0.0265];进一步分析发现,两单抗的联合作用可增强亚群细胞CD8+分泌IFN-γ、CD56+分泌IL-2和TNF-α的活性,从而起到对淋巴细胞功能的增强作用。结论:CD3与CD28单抗联合作用不能增强CIK的增殖能力,但可以在一定程度上增强CIK细胞的功能,在肿瘤的细胞免疫治疗应用中具有一定的潜力。

联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响

目的:研究联合应用CD3/CD28单克隆抗体对小鼠T淋巴瘤细胞EL4活化的影响。方法:ELISA方法检测不同浓度CD3/CD28抗体在不同时间点体外刺激EL4细胞后培养上清中IL-2的分泌;CCK-8方法检测EL4细胞增殖能力;流式细胞术检测EL4细胞周期;RT-PCR检测IL-2、NF-κB和NF-AT转录因子的转录情况。结果:在48小时抗CD3抗体(25μg/ml)与抗CD28抗体(2μg/ml)共刺激EL4细胞明显增加IL-2的分泌和细胞增殖能力,不影响细胞周期。结论:EL4细胞可以作为研究小鼠T淋巴瘤细胞活化的细胞模型。

鼠抗人CD28分子单克隆抗体的研制及生物学特性研究

目的制备鼠抗人CD28分子的单克隆抗体(mAb)，研究其在T细胞的活化、增殖及信号传导中的作用。方法以小鼠淋巴瘤细胞转染人CD28基因的细胞株(CD28-T)为免疫原，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，获取分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株。以体内诱生法生产腹水，并以免疫亲和层析法对其纯化。以快速定性试纸法鉴定mAb的Ig亚类，竞争抑制法分析mAb识别的抗原表位，3H-TdR掺入法研究mAb对T细胞的刺激效应。结果成功地获得了5株分泌特异性抗人CD28 mAb的杂交瘤细胞株，鉴定的1株(克隆18G8)属IgG2a，腹水效价(流式细胞仪分析)达1:2 400以上。该mAb能60％阻断标准鼠抗人CD28抗体与相应抗原的结合，提示其识别的抗原表位与标准mAb不完全相同。mAb 18G8可取代B7-1分子介导的协同刺激信号，促进人外周血T细胞增殖(SI=7)。结论18G8是1株功能性mAb，具有重要的研究和应用价值。

抗人CD38单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的 研制抗人CD38抗原分子的单克隆抗体 ,进一步研究其生物学功能。方法 采用高表达CD38抗原的Daudi细胞免疫Balb c小鼠 ;取其脾细胞与SP2 0细胞融合 ;用间接免疫荧光法进行杂交瘤筛选 ;流式细胞术、免疫沉淀法与CD38分子原核表达产物的Western blot分析鉴定单克隆抗体的特异性。以MTT(四甲基偶氮唑盐 )法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。结果 获得了一株抗人CD38分子的单克隆抗体 1C6 ,流式细胞术显示它具有CD38抗原特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原分子质量为 4 5 0 0 0u。与CD38分子原核表达产物的Western blot分析表明 ,其可特异识别CD38分子胞外结构域。MTT法显示其可介导补体杀伤靶细胞。结论 成功制备了抗人CD38分子的单克隆抗体 ,并进行了初步的功能研究。

5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

目的:制备鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体,研究其对T细胞活化、增殖及信号转导等方面的生物学效应。方法:以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28-T分别作为免疫原和检测细胞株,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行单抗的研制;以快速定性试纸法鉴定单抗亚类;腹水诱生法和免疫亲和层析法进行单抗的制备和纯化;经间接免疫荧光法分析单抗对不同细胞膜表面CD28分子的识别;采用竞争抑制法分析单抗识别的抗原位点;利用3H-TdR掺入法分析单抗对PBTC的刺激效应和免疫荧光法分析PBTC活化前后的表型变化。结果:成功获得5株鼠抗人CD28功能性单克隆抗体,分别命名为2D5、2F5、3B6、3F8和8G8,其中2D5为IgG2a亚类,其余均为IgG1亚类;流式细胞仪分析结果显示,5株单抗均能良好识别CD28-T、U266、XG1和Jurkat细胞表面的CD28分子;竞争抑制试验表明,2D5和8G8能完全阻断标准抗人CD28单抗与U266膜CD28分子的结合,其余3株为部分阻断;3H-TdR掺入法实验结果表明,单抗8G8联合激发型CD3单抗能明显促进PBTC的增殖,刺激指数为7.4,活化细胞CD4、CD25、ICOS、41BB及OX40分子的表达上调。结论:5株单抗均为抗人CD28单克隆抗体,具有重要的基础研究及潜在的临床应用价值。

抗CD_3单克隆抗体HIT3aⅠ.制备和特异性鉴定

利用鼠—鼠杂交技术获得1个单克隆抗体(McAb)HIT3a。经免疫学、细胞化学和生物化学分析,证实HIT3a是抗入成熟T细胞表面CD_3抗原McAb,具有亲和力高、活性稳定、能激活T细胞、在补体存在下溶解T细胞等特性,是1个理想的可用于免疫学研究和临床治疗的CD_3类McAb。

自体及异体CD3单克隆抗体激活杀伤细胞对正常造血细胞的影响

为探索自体及异体CD3单克隆抗体激活杀伤 (CD3AK)细胞对正常造血细胞的影响 ,以固化抗CD3单克隆抗体联合小剂量IL 2诱导CD3AK细胞。采用流式细胞术 (FCM )检测CD3AK细胞的表型变化 ,并检测正常骨髓经与自体或异体CD3AK细胞培养后CD34+ 细胞的比例变化 ,用集落培养检测正常骨髓经与自体或异体CD3AK细胞共同培养后CFU GM的计数变化。结果显示 :3- 5 μg ml固化抗CD3单克隆抗体联合 10 0U mlIL 2可有效地激活CD3AK细胞 ;正常骨髓与异体CD3AK细胞培养 6小时后CD34+ 细胞的比例下降 32 .37%,正常骨髓与自体CD3AK细胞共同培养 6小时后CD34+ 细胞比例升高 5 .4 9%;CFU GM集落培养显示正常骨髓与异体CD3AK细胞共同培养 6小时后CFU GM的计数下降 2 0 .4 4 %,而正常骨髓与自体CD3AK细胞共同培养后CFU GM的数量下降 3.39%。上述结果表明 ,异体CD3AK细胞与正常骨髓造血细胞短期共同培养可产生一定的抑制作用 ,自体CD3AK细胞与骨髓造血细胞短期共同培养无明显影响。

抗CD44单克隆抗体A3D8对人白血病细胞系HL-60细胞增殖及分化的影响

目的 探讨抗CD4 4单克隆抗体A3D8对HL 6 0细胞增殖及分化的影响 ,寻找急性髓系白血病(AML)治疗的新靶点。方法 以AML细胞株HL 6 0为模型 ,通过观察细胞生长、形态学、表面分化抗原、细胞周期和细胞因子表达 ,以及应用硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验来研究抗CD4 4单克隆抗体A3D8对细胞增殖及分化的影响。结果 HL 6 0细胞高表达CD4 4 ;A3D8以浓度和时间依赖性方式抑制HL 6 0细胞生长。A3D8使HL 6 0细胞周期阻滞在G0 /G1期 ,CD11b、CD14表面抗原阳性率明显增高 ,细胞体积增大 ,核 /浆比例减小 ,核染色质聚集 ,NBT还原实验阴性 ,细胞表达粒细胞集落刺激因子mRNA ,呈现向单核细胞系方向分化。结论 A3D8可抑制HL 6 0细胞增殖 ,并诱导其向单核系细胞分化 ,CD4 4有可能成为AML治疗的新途径。

CD3/CD19双特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其再导向的研究

目的制备ＣＤ３／ＣＤ１９双特异性单克隆抗体（ＢｓＡｂ）并研究其生物学作用。方法采用杂交－杂交瘤技术制备ＢｓＡｂ，以双亚类ＥＬＩＳＡ和细胞结合试验确证ＢｓＡｂ的存在，再用５１Ｃｒ释放试验证实ＢｓＡｂ的再导向细胞毒效应。结果获得３株ＣＤ３／ＣＤ１９四源杂交瘤细胞，其中１株已成为稳定分泌ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ的四源杂交瘤细胞株。细胞毒试验表明ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ上清、ＣＤ３／ＣＤ１９纯化抗体以及ＣＤ３／ＣＤ１９化学交联ＢｓＡｂ都能增强ＣＤ３激活杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）对Ｎａｌｍ－６靶细胞的杀伤作用（Ｐ＜０．０５～０．００１）。结论ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ具有显著的再导向激活Ｔ细胞杀伤特异肿瘤靶细胞的功能，提示该ＢｓＡｂ有临床应用的潜在价值。

基因工程化抗CD3单克隆抗体及其诱导免疫耐受的研究进展

CD3单克隆抗体广泛的应用于器官移植的抗排斥反应以及自身免疫病的临床治疗。该抗体的免疫原性和丝裂原活性会导致严重的毒副作用。针对抗体毒副作用进行的基因工程改造取得一定进展,目前已经有许多CD3抗体进入临床试验。抗CD3抗体可以诱导免疫抑制作用,近年来的研究发现,抗CD3抗体具有独特的诱导免疫耐受的能力,即可产生针对特异性抗原的免疫无反应性而不会发生长期的整个免疫系统的抑制状态。

CD3单克隆抗体联合IL-2激活的单个核细胞对白血病细胞体外杀伤作用

抗CD3单克隆抗体(CD3 McAb)对T细胞具有强烈的丝裂原作用。作者研究证实CD3McAb联合IL-2激活的杀伤细胞(CD3 AK)对人急性白血病新鲜细胞和K562细胞均有明显的杀伤作用。正常人CD3 AK细胞对各型急性白血病细胞杀伤活性无差别;正常人与白血病缓解期的CD3 AK细胞杀伤力类同,且自体与异体亦无区别;但复发期CD3 AK细胞杀瘤作用明显减弱。血型不影响CD3 AK细胞的杀伤作用。

^(131)I标记抗CD20单克隆抗体在荷瘤裸鼠体内的放射免疫显像

目的探讨131I-anti-CD20McAb经瘤内注射后在荷人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞移植瘤裸鼠体内的放射免疫显像。方法131I标记物的标记采用IODO-GEN碘化标记;注射标记物后第1、3、7、15天将荷瘤裸鼠SPECT显像后活杀,定标器测量并计算瘤、血等12种器官或组织的%ID/g值,根据MIRD委员会推荐的公式计算肿瘤累积吸收剂量。结果131I-anti-CD20McAb瘤内注射组的SPECT显像结果优于腹腔注射组和131I-IgG瘤内注射组,该组肿瘤%ID/g值在给药后第1、3和7天分别为后两组的1.4～17倍和1.7～3.7倍,肿瘤累及吸收剂量在给药后第3、7和15天分别为后两组的1.5～2.5倍和6.0～12.6倍。结论131I-anti-CD20McAb经瘤内途径给药可以使肿瘤获得最高的放射性药物摄取率,为下一步运用该途径进行放射免疫治疗提供了实验依据。

抗胸腺细胞球蛋白与抗CD3单克隆抗体治疗皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病的疗效比较

目的 比较抗胸腺细胞球蛋白 (ATG)和抗CD3单克隆抗体联合大剂量甲基强的松龙 (MP)治疗皮质激素耐药急性移植物抗宿主病 (aGVHD)的疗效。方法 11例异基因外周血干细胞移植的病患者 ,移植后发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD ,经大剂量MP治疗 3～ 9d无效后接受ATG(ATG组 )或抗CD3单克隆抗体 (WuT3组 )联合大剂量MP治疗。ATG 2 .5mg/ (kg·d) ,连续 5～ 7d ;WuT35mg/ (kg·d) ,10～ 14d后停药 ;MP 5mg/ (kg·d) ,aGVHD控制后逐渐减量。 结果 ATG组 :7例中 4例获完全缓解 (CR)、2例部分缓解 (PR)、1例无效 (NR) ,总有效率 85 .7%。WuT3组 :1例获CR、1例PR、2例NR ,1例获CR患者至今已存活 8个月 ,缓解后出现CMV阳性。 4例中有 3例治疗中合并感染。结论 ATG联合大剂量MP治疗皮质激素耐药aGVHD优于抗CD3单克隆抗体。早期ATG联合大剂量MP治疗激素耐药的aGVHD具有较高的疗效。

短期应用单克隆抗体CD_3预防肾移植术后早期排斥反应

①目的 探讨短期应用单克隆抗体CD3 (OKT3 )预防肾移植术后早期严重排斥反应的效果和安全性。②方法 对照组 35例肾移植病人术后常规应用甲基泼尼松龙、环磷酰胺、泼尼松、骁悉和环孢霉素A ;实验组33例在上述用药基础上 ,术后前 5d连续应用OKT3 5mg静脉注射。③结果 实验组除 1例肾小管坏死的病人因发生急性排斥反应、自发性移植肾破裂而切除肾脏 ,无其他严重并发症。对照组 2例发生加速排斥反应 ,应用OKT3 后 1例加速排斥反应逆转 ,1例死亡 ;4例发生急性排斥反应 ,应用OKT3 后全部逆转。两组排斥反应发生率比较差异有显著性 (χ2 =4 .72 5 ,P <0 .0 5 )。④结论 肾移植术后短期应用OKT3 能有效地预防早期严重排斥反应 。

聚乙二醇修饰鼠抗人CD3单克隆抗体

目的:确定一条聚乙二醇化鼠抗人CD3单克隆抗体(mAb)和抗体片段的制备工艺路线。方法:以胃蛋白酶酶解并通过凝胶柱分离和纯化得到抗体Fab′,利用PEG-SPA修饰抗体和抗体片段Fab′上的氨基,通过体内和体外T细胞增殖实验,考查修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性。结果:较佳的修饰工艺条件为:在pH9.0硼酸缓冲液,反应温度25℃,抗体浓度0.2g/L,抗体和聚乙二醇摩尔比为1∶20,反应3h。修饰后抗CD3mAb全抗,对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.3%,抗体Fab′下降了8.0%,PEG化Fab′下降了19.9%。利用ELISA检测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期。结果显示mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓,修饰后抗CD3抗体半衰期从2.66h延长到8.72h,延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.21h延长到4.17h,延长了1.90倍。结论:利用聚乙二醇修饰抗体和抗体片段,提高了抗体半衰期,且无细胞毒性,活性损失较小,该技术具有较高的可行性,可极大地提高mAb尤其是非人源性抗体在临床上的应用。

鼠抗人TCR/CD3单克隆抗体的制备及其初步应用

目的应用B淋巴细胞杂交瘤技术,制备鼠抗人CD3单克隆抗体,并用于T淋巴细胞亚类检测。方法以本室纯化的CD3蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,成功地获得1株抗人CD3单克隆抗体。经间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合SDS-PAGE实验考察单克隆抗体对CD3促T淋巴细胞增殖活性的作用。结果杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为20 mg/mL,效价为10-7,并对T淋巴细胞有促增殖活性,检测正常人外周血阳性T细胞百分率为(73±7)%。结论制备的抗人CD3单克隆抗体具备较高的纯度和活性,可用于T细胞亚类的检测。

α－CD_3单克隆抗体对肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

为寻找更有效的肿瘤过继性免疫治疗的方案，用α－ＣＤ３单克隆抗体（单抗）激活ＦＢＬ－３红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性Ｔ细胞，并观察α－ＣＤ３单抗对肿瘤特异性Ｔ细胞的增殖、杀瘤活性及表型的影响。体外实验结果显示，免疫小鼠脾细胞经α－ＣＤ３单抗激活后，采用低剂量ＩＬ－２即可维持其长期高度的、持续的增殖；又培养过程中α－ＣＤ３单抗持续存在可大大促进其对肿瘤的特异性杀伤。细胞分型分析结果也支持了α－ＣＤ３单抗的持续存在对维持肿瘤特异性Ｔ细胞的抗瘤活性具有很重要的意义，是肿瘤过继免疫疗法中颇有前景的治疗方案。