内皮祖细胞CD34抗体包被冠脉支架对猪冠状动脉再狭窄影响的研究

目的探讨生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架是否可降低猪冠状动脉支架置入术后再狭窄。方法以生物可降解高分子聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸共聚物为载体,应用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)方法制成内皮祖细胞CD34抗体洗脱支架。18只猪随机分为三组,即紫杉醇支架组、CD34抗体支架组、裸支架组,每组6只,将紫杉醇支架、CD34抗体支架、裸支架分别植入到各组猪的冠状动脉损伤段,4w后处死,取出支架段血管行病理学观察及计算机图像分析血管管腔面积、内膜增生面积以及面积狭窄百分比。结果CD34抗体支架组内膜增生面积较裸支架组减低(P<0.05),紫杉醇支架组内膜增生面积较裸支架组也减低(P<0.05),但较CD34抗体支架组无明显差别(P>0.05)。结论生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架可明显加速支架置入术后血管内皮修复,降低再狭窄的发生。

抗CD3/CD45双特异抗体激活的效应细胞对白血病细胞的杀伤效应

目的探讨双特异性抗体用于白血病自体干细胞移植体外净化的可能性。方法以抗ＣＤ３／ＣＤ４５双特异性抗体激活外周血单个核细胞，以ＨＬ６０为靶，用ＬＤＨ方法测定杀伤效应。结果靶效比例不同时，抗ＣＤ３／ＣＤ４５激活的效应细胞对ＨＬ６０细胞都表现出杀伤效应。结论抗ＣＤ３／ＣＤ４５可能用于骨髓／造血干细胞移植的体外净化。

去细胞光氧化牛颈静脉血管片内膜光化学接枝CD34抗体的制备及初步评价

目的:用光交联剂SANPAH将不同浓度鼠抗人CD34抗体接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉表面,明确接枝鼠抗人CD34抗体的最佳反应摩尔比和最佳浓度。方法:实验于2006-06/08在中南大学湘雅二医院生物材料实验室完成。按4个不同摩尔比(1∶0,1∶10,1∶20,1∶50),SANPAH和4个不同浓度[0.665μmol/L(100mg/L),1.33μmol/L(200mg/L),6.65μmol/L(1g/L),13.3μmol/L(2g/L)]鼠抗人CD34抗体进行反应后,经紫外线照射光化学接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉上,各组进行快速冰冻切片,滴加FITC标记的羊抗鼠IgG,然后在荧光显微镜下观察不同摩尔比和浓度反应结合的荧光效果,从而初步推断出最佳的反应和结合的摩尔比和浓度。结果:随着鼠抗人CD34抗体的浓度的升高,荧光整体上是越来越强,但是当浓度高于6.65μmol/L时,荧光差别不是很明显;当二者的反应摩尔比为1∶20时,荧光最强。结论:最佳的鼠抗人CD34抗体和SANPAH反映接枝的浓度是6.65μmol/L,最佳的摩尔比是1∶20。

抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性测定方法的建立

目的建立基于报告基因的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法。方法以WIL2-S细胞系作为靶细胞,以Jurkat-NF-κB-Luc转基因细胞系作为效应细胞,对抗体的量效范围、孵育时间、诱导时间、效靶比及细胞接种密度进行优化,构建可用于测定抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性的报告基因法。依据ICHQ2的指导原则对方法进行全面验证,包括专属性、准确性、精密度、线性、稳定性。结果成功建立了具有量效关系的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法的抗体起始浓度为500 ng/mL,稀释倍数为1∶4,共计8个浓度点(500,125,31.25,7.81,1.95,0.49,0.12,0.031 ng/mL),效靶比为4∶1,诱导时间为4 h。本方法具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经测定,相对效价分别为59.63%±4.57%,75.54%±4.05%,99.98%±9.63%,123.90%±5.54%和142.51%±12.82%;对应的回收率分别为93.17%±7.15%,94.42%±5.06%,99.98%±9.63%,99.12%±4.43%以及91.21%±8.21%,CV分别为7.67%,5.35%,9.63%,4.47%和9.00%,上述结果的变异系数CV值均<10%;实测效价与理论效价线性回归分析相关系数R^(2)=0.9823,线性良好;本研究建立的方法可以敏感检测出抗体结构变化对生物活性的影响,对双特异性抗体的稳定性检测有一定的指导意义。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性。

地中海贫血患儿血清群体反应性抗体对脐血CD34^+细胞增殖和凋亡的影响

本研究探讨特异性群体反应性抗体(panel reactive antibody,PRA)对脐血CD34+细胞的影响。取含PRA的β地中海贫血患儿血清,与脐血CD34+细胞、补体联合孵育,观察其对CD34+细胞的影响,并以[3H]TdR掺入法测定细胞DNA合成及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,PRA血清组细胞培养上清中乳酸脱氢酶水平高于对照组;PRA血清组脐血CD34+细胞DNA合成能力较对照组下降。流式细胞仪检测显示,各实验组间脐血CD34+细胞凋亡率差异无统计学意义。结论:特异性PRA血清对脐血CD34+细胞的增殖有抑制作用,补体可增强上述作用;特异性PRA血清对脐血CD34+细胞的凋亡无明显影响。

CD34抗体包被支架植入预防兔动脉支架内狭窄的研究

目的探讨CD34抗体包被支架植入预防兔动脉支架内狭窄的效果。方法经颈动脉入路建立兔髂动脉损伤模型,损伤后即刻于右侧植入普通支架,左侧植入抗体支架。45 d取样6只,观察CD34抗体包被支架的效果、支架内最狭窄处管腔的百分率及CD34抗体包被支架内新生内膜面积的百分率。结果荧光显微镜下观察结果显示,抗体包被均匀密集。实验组支架内最狭窄处管腔的百分率为(16.13±3.93)%,明显低于对照组[(47.03±11.89)%](P<0.05)。实验组CD34抗体包被支架内新生内膜面积的百分率为(49.64±6.40)%,明显低于对照组[(66.83±6.00)%](P<0.05)。结论CD34抗体包被支架能够有效减轻受损动脉支架内狭窄的发生。

抗CD34抗体抵消雷帕霉素洗脱支架内皮延迟修复研究

目的:雷帕霉素洗脱支架在降低再狭窄风险的同时,通过抑制血管再内皮化,可能增加支架内血栓发生风险,抗CD34抗体通过特异捕获血液中内皮祖细胞,加速支架术后血管再内皮化。本研究目的是将抗CD34抗体涂敷到雷帕霉素洗脱支架上,通过实验小猪支架术后不同时间造影,随访评价抗CD34抗体对雷帕霉素洗脱支架早期再内皮化的影响。方法:将3种不同类型的支架包括金属裸支架(bare-metal stents,BMS)、雷帕霉素洗脱支架(sirolimous-eluting stents,SES)和抗CD34抗体与雷帕霉素洗脱联合支架(anti-CD34 antibody and sirolimous-eluting combined stents,ASES)随机植入到符合条件的10头中华小型猪冠状动脉内(共植入了6个BMS、7个支架和7个ASES),支架植入术后2 w,进行冠状动脉造影及冠状动脉内光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)检查;动物处死后,对支架段冠状动脉进行病理组织学检查及扫描电镜观察。结果:1.通过对冠状动脉造影、OCT图像及支架段冠状动脉的病理组织学的观察分析,均未发现支架内血栓及小的附壁血栓。2.在2 w OCT检查图像上,ASES新生内膜覆盖率显著高于SES[(55.56±35.27)%vs.(41.82±23.28)%,P=0.047],ASES平均内膜覆盖厚度不但显著高于SES[(89±5.0)μm vs.(32±4.9)μm,P<0.001]、还高于BMS[(89±5.0)μm vs.(44±7.2)μm,P=0.001]。病理组织学观察及扫描电镜观察也显示,ASES和BMS新生内膜覆盖水平及质量均优于SES。结论:将抗CD34抗体联合应用到雷帕霉素洗脱支架上,能够显著抵消后者在支架术后早期对再内皮化的抑制作用。

雷帕霉素联合CD34抗体复合支架快速捕获外周血中内皮祖细胞

背景:临床用于治疗血管狭窄疾病的药物洗脱支架和单纯内皮修复型支架存在内皮化延迟和植入后再狭窄的问题。雷帕霉素联合CD34抗体复合支架可协同抵消抗增殖药物的内皮化延迟和内膜的过度增生,目前尚处于实验研究阶段。目的:观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架捕获内皮祖细胞能力及其所捕获内皮祖细胞的分化特征。方法:通过扫描电镜及间接免疫荧光观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架体外捕获外周血内皮祖细胞形态及其分化特征。通过荧光显微镜观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架植入兔耳动脉后捕获内皮祖细胞情况及支架片段的内皮化程度。结果与结论:扫描电镜观察到CD34抗体涂层支架可捕获直径6-8μm的纺锤状细胞,24 h时细胞变得充盈饱满。所捕获细胞具有内皮祖细胞的外形特征。间接免疫荧光观察CD34抗体支架表面可见大量血管内皮生长因子受体2阳性细胞黏附的红色荧光斑点。免疫荧光观察到CD34抗体涂层支架植入兔耳动脉24 h大部分被血管内皮细胞所覆盖,48 h达到完全覆盖,未见细胞异常聚集。结果表明雷帕霉素联合CD34抗体复合支架能特异性快速捕获外周血液中的血管内皮祖细胞,植入体内48 h即可完成血管内皮细胞覆盖,实现了支架快速内皮化,可促进内皮细胞修复。

B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中的作用

目的:探讨B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中的作用。方法:抗CD45RB抗体对BALB/c裸鼠进行预处理后制备脾脏单细胞悬液,与BALB/c小鼠T淋巴细胞和C57BL/6小鼠脾细胞混合培养,流式细胞术分析Th1、Th2、Treg和Tm淋巴细胞。以B6.μMT^(-/-)小鼠为受体、BALB/c小鼠为供体建立皮肤移植模型,移植后向受体鼠腹腔注射抗CD45RB单抗,监测脾淋巴细胞CD3^+CD45RB^(hi)细胞比例。在混合淋巴培养过程中加入抗CD45RB单抗,分离B细胞,建立以BALB/c小鼠为供体、B6.μMT^(-/-)小鼠为受体的心脏移植模型,通过尾静脉注射B细胞给B6.μMT^(-/-)小鼠,观察受体鼠生存期和B细胞分布。结果:在裸鼠体内用抗CD45RB抗体处理过的B淋巴细胞,与T淋巴细胞混合培养时,可使Treg和Th2淋巴细胞比例明显升高,Th1淋巴细胞的比例明显下降,Tm细胞无明显变化。在体内B淋巴细胞缺失的情况下,抗CD45RB抗体依然能够降低T细胞表面CD45RB的表达,与对照组B淋巴细胞存在组相比,抗CD45RB抗体对T淋巴细胞表面CD45RB下调更为快速,但最终CD3^+CD45RB^(hi)T细胞比例无明显变化。体外抗CD45RB抗体处理过的B淋巴细胞可以延长受体鼠的生存时间。B6.μMT^(-/-)鼠在接受抗CD45RB抗体处理的B细胞并进行同种异体心脏移植后,B细胞可向胸腺迁移。结论:在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中,B淋巴细胞可能通过介导各T淋巴细胞亚群比例发挥着重要作用,且在中枢耐受中也起到一定作用,但是仅靠B淋巴细胞无法形成完全耐受。

MIP-1β,TGF-β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34^+细胞扩增的作用

目的 研究MIP 1 β ,TGF β抗体对人基质细胞支持的脐血CD34 + 细胞扩增的作用。方法 免疫磁珠法分选脐血中CD34 + 细胞 ,接种到预先照射的基质层上。分为 4组 :MIP 1 β( 30 0ng/ml)组 ,TGF β抗体 ( 2 0 μg/ml)组 ,MIP 1 β +TGF β抗体 ( 5 μg/ml)组和对照组 (不加细胞因子 )。第 5天半换液并加入MIP 1 β ,TGF β抗体 ( 2 0 μg/ml)和MIP 1 β +TGF β抗体 ( 5 μg/ml)。第 1 0天结束培养。第 5、1 0天收获细胞分别做细胞计数 ,集落培养法检测造血祖细胞数量 ,流式细胞术检测CD34 + 细胞数。结果 MIP 1 β组第 5、1 0天有核细胞数 ,造血祖细胞数 ,CD34 + 细胞数与对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。TGF β抗体组 ( 2 0 μg/ml)及MIP 1 β +TGF β抗体 ( 5 μg/ml)组第 5天有核细胞数与对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,第 1 0天有核细胞数与对照组相比差异显著 (P <0 .0 5 )。第 5、1 0天造血祖细胞数 ,CD34 + 细胞数与对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 与对照组相比 ,MIP 1 β对人基质细胞支持的脐血CD34 + 细胞无明显的体外扩增作用。在TGF β抗体 ( 2 0 μg/ml)或MIP 1 β +TGF β抗体 ( 5 μg/ml)作用下 ,人基质细胞支持的脐血CD34 + 细胞可在 1 0d内扩增 1～ 3倍。

注射抗CD20单克隆抗体后发生荨麻疹性血管炎一例

患者,女,61岁。全身皮肤泛发红斑1天。起病前7天因“红斑型天疱疮”应用抗CD20单克隆抗体治疗。用药后躯干、四肢泛发水肿性红斑。结合组织病理诊断为荨麻疹性血管炎。给予甲泼尼龙、氯雷他定等治疗,4天后患者皮疹逐渐消退,原有红斑部位可见色素沉着斑。随访8个月,皮疹未复发。

地中海贫血患儿群体反应性抗体对脐血CD34+细胞集落形成的影响

目的探讨特异性群体反应性抗体(Panel Reactive Antibody,PRA)对脐血CD34+细胞集落形成的影响。方法取含PRA的β地贫患儿血清,与脐血CD34+细胞、补体联合孵育,行半固体集落培养,观察其对CD34+细胞集落形成影响。结果经PRA阳性血清孵育的脐血CD34+细胞经半固体集落培养所形成的集落数下降。结论地中海贫血血清PRA对脐血CD34+细胞的集落形成能力有抑制作用,补体可增强上述作用。

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

目的 克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA ,并构建其真核表达载体 ,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法 从KG 1a细胞提取总RNA ,RT PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定 ,构建其真核表达载体pcD NA3 1 CD34。选取 4～ 6周龄的BALB/c小鼠 12只 ,随机分为 3组 ,预先在股四头肌注射 2 5 %的蔗糖溶液 5 0 μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3 1以及PBS稀释的pcDNA3 1 CD34,每 2周 1次共 3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果 所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长 886bp ,扩增片段大小与理论值相符 ,测序结果与文献报道完全一致 ,并且在 5′端引入HindⅢ酶切位点 ,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体 pCD NA3 1中 ,称之为pcDNA3 1 CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实 pcDNA3 1 CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明 ,用pcDNA3 1 CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅 1/ 4只在免疫结束后的第 2～ 6周有较低滴度的CD34抗体产生 ,其余 3只血清中均未检测到CD34抗体。结论 成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体 pcDNA3 1 CD34。

抗CD_(34)单克隆抗体标记血管生成在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义

应用免疫单抗标记的组织化学技术检测 63例人脑胶质瘤组织中 CD3 4 的表达情况 ,根据 CD3 4 阳性的血管内皮细胞计数来测定肿瘤微血管密度 (MVD)。结果发现 , 、 级胶质瘤 MVD显著高于 、 级 (P<0 .0 5 ) ;术后 18个月内复发和生存期 <3年者 MVD显著高于术后 18个月内无复发和生存期≥ 3年者 (P<0 .0 1) ;MVD与患者的性别、年龄、肿瘤生长部位无明显相关 (P>0 .0 5 )。认为人脑胶质瘤组织中血管形成与病理分级、术后复发及生存期密切相关 。

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。

CD34抗体修饰的脱细胞血管支架的体内内皮化

目的研究CD34抗体修饰的脱细胞血管支架植入动物体内后募集循环中的内皮祖细胞参与再内皮化过程的性能。方法新鲜的羊前肢动脉经反复冻融和超高压处理,SDS彻底去除细胞,通过光交联法将CD34抗体固定于脱细胞血管内腔面。20只新西兰大白兔右下腹做一带蒂皮瓣,皮瓣供血动脉为股动脉的分支血管,血管移植部位选取股动脉,做1cm长的全段缺损,随机分为2组(n=10),实验组选用CD34抗体修饰的脱细胞血管支架,对照组用未修饰的脱细胞血管支架,显微外科端端吻合替代缺损的兔股动脉。术后通过对皮瓣色泽质地的观察,了解皮瓣的血供情况;行彩色多普勒、数字减影血管造影检查和病理切片观察移植血管的通畅情况及细胞黏附情况。结果实验组皮瓣术后血运较好,对照组皮瓣术后肿胀坏死。彩色多普勒、数字减影血管造影检查显示,实验组移植术后1周有3只动物发生血管闭塞,另7只动物在术后4周血管仍通畅、无明显狭窄;对照组术后1周无1只动物血管通畅。实验组术后4周解剖移植血管,H-E染色显示脱细胞血管支架表面形成连续融合单层细胞,管腔无明显狭窄;对照组术后1周解剖移植血管可见血栓形成,H-E染色显示血管腔内表面缺乏细胞覆盖。结论CD34抗体修饰的脱细胞血管支架在早期抗凝及通畅率上均优于未经修饰的脱细胞血管支架。

抗TGF-β抗体对人脐血CD34^+细胞体外扩增及黏附分子表达的影响

本研究的目的是证实抗TGF-β抗体在人脐血CD34+细胞体外扩增过程中可以增加CD34+细胞的扩增效率,并观察其对脐血CD34+细胞粘附分子表达的影响。从6份新鲜脐血标本中富集CD34+细胞,将其接种于含抗TGF-β抗体+SCF+Flt-3L+TPO+IL-3因子组合的SFEM无血清培养体系中,培养6天后,细胞计数,并用FACS检测CD34、c-kit(CD117)、CD11a、CD49d、CD33表达情况,同时进行集落分析。结果表明:①实验组有核细胞数、CD34+细胞数、CD34+c-kit+细胞数及CFU-GEMM分别扩增了41.82±13.49,15.62±6.95,13.36±6.12,11.07±4.05倍,明显高于对照组(P分别=0.001,0.002,0.003,0.002),其中实验组中更为早期的CD34+c-kit-亚群的扩增倍数更多(69.10±41.06),多于有核细胞、CD34+细胞、CD34+c-kit+细胞的扩增倍数(P=0.024)。②TGF-β抗体对CD11a和CD49d的表达无明显影响(P值均大于0.05)。结论:抗TGF-β抗体可协同早期干细胞生长因子有效扩增脐血CD34+细胞,同时不降低CD34+细胞黏附分子的表达。

抑制T细胞增殖的抗CD45单克隆抗体的建立

目的寻找能调节T细胞功能的相关分子,进行与T细胞介导的自身免疫性疾病相关的研究。方法从BALB/c小鼠骨髓中收集树突状细胞,免疫Wistar大鼠,进行细胞融合,建立杂交瘤细胞系。筛选得到很多株能调节T细胞功能的杂交瘤细胞系,对其中一株最能抑制T细胞增殖的杂交瘤细胞系进行了进一步的深入研究。结果显示其目标分子是CD45,同时增殖实验结果显示该抗体能显著抑制T细胞增殖反应。结论抗CD45单克隆抗体能有效抑制T细胞增殖,有望将本抗体用于T细胞介导的自身免疫性疾病的相关预防及治疗中。