抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的 :构建抗CD71人 鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法 :将鼠源性抗CD71单抗 (75 79)重、轻链可变区基因 (VH 和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ Expr和pκ Expr中 ;将嵌合表达载体 (Chi75 79 pγ Expr和Chi75 79 pκ Expr)经电转染技术共转染至真核细胞 (SP2 0 )中。结果 :经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清 ,证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区 (Cγ)和轻链恒定区 (Cκ)蛋白 ;通过间接免疫荧光流式细胞术 (FCM)和间接免疫荧光显微技术 ,证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CD71分子。结论 :抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)在体外真核细胞表达成功。

分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性与稳定性的研究

目的 研究在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性、稳定性及抗体产量。方法 利用人IgG和鼠IgG作为浓度标准 ,绘制浓度曲线 ,比较研究转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。腹腔接种转染瘤细胞诱导裸鼠产生腹水抗体 ,经离子交换法纯化 ,电泳鉴定纯化嵌合抗体。结果 1× 10 5个 5ml转染瘤细胞培养 5天的上清中 ,嵌合抗体分泌量为 (0 .5～ 5 ) μg ml。Balb c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 (3～ 5 )ml,腹水抗体经纯化 ,抗体产量约为 (1～ 2 )mg (ml腹水 )。经离子交换法纯化 ,电泳鉴定 ,在分子量 5 5kDa和 2 5kDa处 ,可见有抗体IgG蛋白质的重链和轻链的染色条带。结论 由我们制备的在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,产量高 ,特异性强。

抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究

目的 对抗 CD71人 -鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究。方法 以表达 CD71分子的 3种人类肿瘤细胞( K5 62 ,CEM和 SMMC- 772 1)为靶细胞 ,以正常人外周血单个核细胞 ( PBMC)为效应细胞 ,在效 /靶细胞比为 5 0∶1的条件下 ,测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应 ( ADCC) ;以 CEM和 SMMC- 772 1为靶细胞 ,在有新鲜补体存在下 ,测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应 ( CDC)。结果 抗 CD71人 -鼠嵌合抗体 ( D2 C)能够通过识别 CD71分子 ,并通过人抗体 Fc段介导 ADCC。在有新鲜补体存在下 ,介导 CDC。结论 抗 CD71人 -鼠嵌合抗体对 CD71+肿瘤细胞可介导 ADCC和 CDC。

抗CD71人-鼠嵌合抗体的制备及其诱导肿瘤细胞凋亡

目的 :研究在液氮中冻存 2年的转染瘤细胞株 (D2C)复苏后其分泌抗CD71人 -鼠嵌合抗体的特异性、分泌量及诱导肿瘤细胞凋亡的效应。方法 :用ELISA方法检测转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。经DEAE SephadexA 5 0离子交换法纯化产生的抗体 ,并采用SDS PAGE电泳鉴定 ;台盼蓝拒染法观察其对K5 6 2细胞生存的影响 ;细胞计数和MTT试验测定嵌合抗体及鼠源性抗体对K5 6 2细胞的作用 ;琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察K5 6 2细胞凋亡。结果 :Balb/c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 3～ 5mL。抗体经纯化 ,产量约为 1～ 2mg/mL腹水。经SDS PAGE电泳鉴定 ,在分子量 5 5kD和 2 7kD处 ,可见有抗体IgG重链和轻链的染色条带。抗CD71嵌合抗体及鼠源性抗CD71抗体均可抑制K5 6 2细胞的增殖作用 ,且二者抑制作用无显著性差异 (P >0 .0 5 )。经琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察分别可见抗体诱导的K5 6 2细胞DNA梯形条带和细胞凋亡的形态改变。结论 :液氮中冻存 2年的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,特异性高 ,并可诱导K5 6

抗CD71人-鼠嵌合抗体对活化淋巴细胞的效应

目的 通过体外实验探讨抗CD71人 鼠嵌合抗体对活化淋巴细胞效应的影响 ,并与其鼠源性单克隆抗体进行比较。方法 以丝裂原诱导的人外周血单个核细胞 (PBMC)为靶细胞 ,测定嵌合抗体和鼠源性单抗对其增殖抑制率 ;在新鲜补体存在下 ,测定补体依赖性嵌合抗体介导的细胞毒效应(CDC)。以EBV转化的B细胞为刺激细胞 ,测定两种抗体对其诱导的同种异体PBMC的增殖抑制率 ;以同种异体的PBMC为刺激细胞 ,测定两种抗体在单向、双向混合淋巴细胞培养 (MLC)中的增殖抑制率。结果 嵌合抗体和鼠源性单抗均可明显抑制丝裂原诱导的PBMC的增殖反应 ,且二者抑制率差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,其抑制作用随抗体浓度增加而增强 ,PBMC和丝裂原共同孵育 12h后加入抗体的增殖抑制效应最明显 ;在新鲜补体存在下 ,嵌合抗体对丝裂原诱导增殖的PBMC具有CDC作用 ,而鼠源性单抗CDC作用较弱 ;两种抗体对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用 ,且嵌合抗体组抑制率明显高于鼠源性单抗组 (P <0 .0 5 )。结论 抗CD71人 鼠嵌合抗体在体外实验中可抑制淋巴细胞的活化及其效应 ,其作用明显强于抗CD71鼠源性单克隆抗体。

抗CD71人-鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其机制探讨

目的 研究抗CD71人 鼠嵌合抗体诱导K5 6 2细胞凋亡的效应及其机制。方法 台盼蓝拒染法观察抗CD71人 鼠嵌合抗体对K5 6 2细胞生存的影响 ;细胞计数和MTT试验测定嵌合抗体及鼠源性抗体对K5 6 2细胞的作用 ;琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察K5 6 2细胞凋亡 ,以AnnexinⅤ检测其凋亡率及进行细胞周期分析 ;并检测胞浆中细胞色素C和活化的caspase 8的相对含量。结果 抗CD71嵌合抗体及鼠源性抗CD71抗体均可抑制K5 6 2细胞的增殖作用 ,且二者抑制作用差异无显著性(P >0 .0 5 )。经琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察分别可见抗体诱导的K5 6 2细胞DNA梯形条带和细胞凋亡的形态改变 ,细胞周期分析可见其将细胞周期阻止在G1 期 ,胞浆中细胞色素C含量增加而活化的caspase 8的含量不增加。结论 抗CD71人 鼠嵌合抗体可通过线粒体死亡途径诱导K5 6 2人红白血病细胞凋亡 ,其诱导凋亡可能与其干扰细胞铁离子转运有关。

抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定及对PBMC增殖反应的影响

目的对已构建表达的抗 CD4人 -鼠嵌合抗体的生物学特性进行鉴定 ,比较嵌合抗体与鼠源性单抗对抗 CD3Mc Ab和 EBV转化细胞诱导的外周血单个核细胞 (PBMC)增殖反应的影响 ,以探讨抗 CD4抗体的增殖抑制作用机制。方法采用间接免疫荧光竞争抑制实验比较两种抗体对 CD4抗原的相对亲和力 ,MTT法检测抗 CD4抗体的增殖抑制作用。结果转染瘤细胞具有稳定表达及分泌特异性抗 CD4人 -鼠嵌合抗体的能力 ;两种抗体对 CD4抗原的相对亲和力相同 ;对经 TCR途径刺激诱导的 PBMC增殖反应均有抑制作用 ,嵌合抗体的增殖抑制作用较鼠源性单抗强。结论抗 CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于 TCR诱导的活化信号。

抗CD4人-鼠嵌合抗体的生物学特性及作用机理探讨

目的 比较抗 CD4人 -鼠嵌合抗体与鼠源性单抗在单向混合淋巴细胞反应 (ML R)和兔皮内移植物抗宿主反应(GVHR)中的作用 ,及嵌合抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒 (ADCC)和补体依赖细胞毒 (CDC)活性 ,以进一步探讨抗CD4嵌合抗体的增殖抑制作用机理。方法 用四甲基偶氮唑盐比色分析法检测抗 CD4抗体在单向 ML R中的抑制作用。以免疫抑制剂处理后的大白兔作为 GVHR的动物模型 ,对抗体的增殖抑制作用进行体内实验。结果 抗 CD4抗体对同种细胞性抗原诱导的外周血单个核细胞增殖反应有明显的抑制作用 ,能明显抑制 GVHR的阳性反应 ,嵌合抗体的抑制作用较鼠源性单抗强。抗 CD4嵌合抗体具有 ADCC效应 ,而无 CDC效应。结论 抗 CD4抗体可能通过多种抑制机制下调 CD4+ T细胞介导的免疫反应 。

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应

目的:在运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上,探讨B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/D28信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法:取6周龄雌性C57BL/6J小鼠,予一次性腹腔注射Pristane 0.5ml/只,每月定期检测小鼠的尿蛋白、ANA及肾脏病理学改变。取尿蛋白含量达到++,ANA荧光强度达到++的小鼠随机分为3组,每组5只。抗体干预组用B7-1人-鼠嵌合抗体经眼眶静脉序贯给药,阳性对照组注射免疫抑制剂CTX,阴性对照组注射人同型Ig G。每月定期检测尿蛋白及ANA,干预至3个月时,处死小鼠,取肾脏进行H&E染色分析,免疫复合物(IC)检测及透射电镜观察。结果:Pristane诱导至4个月时,80%的小鼠尿蛋白含量达到+^+++,血清ANA荧光强度为++^+++,出现尿蛋白及ANA的小鼠,其肾小球炎性细胞侵润,肾小管上皮样细胞可见水肿样变性、血管充血明显,纤维组织增生。抗体干预后,尿蛋白逐渐由++^+++降为±^++,ANA由++^+++降为+^++。与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.01)。肾脏HE染色分析的结果显示,抗体干预组肾小球炎性细胞侵润及肾小管充血等表现均得到明显改善。免疫荧光染色可见抗体干预组抗原抗体复合物(IC)的荧光强度明显减弱。经透射电镜观察,抗体干预组与阴性对照组相比,肾小球的电子致密物沉积减少,基底膜厚度趋于均匀。结论:B7-1抗体通过抑制B7-1/CD28信号通路下调机体的免疫应答,减少自身抗体的产生,对自身免疫造成的病理损伤具有逆转作用。

^(99)Tc^m-抗人膀胱癌-人鼠嵌合抗体在荷人膀胱癌裸鼠的放射免疫显像

目的 研究99Tcm 抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体ch BDI对膀胱癌细胞的体外结合性能、在荷人膀胱癌裸鼠中的体内分布及对肿瘤的靶向定位性能。方法 用改进的Schwarz方法进行99Tcm 标记 ,经SephadexG 5 0柱分离纯化。用纸层析法测定标记率与放化纯 ;用Lindmo的方法测定免疫活性分数 ;用Scatchard作图法求得亲和常数。荷人膀胱癌裸鼠静脉注射99Tcm ch BDI 11.1MBq(30 μg) ,分别于 2、6、2 0及 2 4h行放射免疫显像。用感兴趣区 (ROI)技术获得全身和肿瘤放射性计数及肿瘤与对侧正常组织 (T NT)的放射性比值。 2 4h显像后处死裸鼠 ,测定体内放射性分布 ,计算每克组织百分注射剂量率 (%ID g)及T NT比值。结果 99Tcm ch BDI标记率为 (6 6 .5± 7.3) % ,放化纯 >90 % ,免疫活性分数为 76 % ,亲和常数为 3.5 6× 10 9L mol。荷人膀胱癌裸鼠放射免疫显像结果示 ,静脉注射后 6h肿瘤显影清晰 ,随时间延长更清晰。全身放射性计数随时间延长迅速降低 ,肿瘤放射性计数下降缓慢 ,T NT比值随时间增高。荷瘤裸鼠体内分布结果示 ,静脉注射后 2 4h肿瘤 %ID g为 17.4 ,除肾脏外 ,肿瘤与其他正常组织有很高的T NT比值 ,与脑、肌肉、小肠壁、骨骼及心壁的T NT比值分别为 136 .0、5 5 .1、39.3、2 9.7及 2 7 9。结论 ch BDI具有良?

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样肾炎的免疫干预效应

目的探讨在诱导c GVHD小鼠狼疮样肾炎模型并通过各项指标鉴定其造模成功的基础上,运用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/CD28共刺激信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法将6~8周龄雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠随机分为4组,模型组于0、3、7和11 d经眼眶静脉注射100μL雌性亲代BALB/c小鼠脾脏细胞107/只。抗体干预组在造模后第1、3、5、8、15、30及60天分别经眼眶静脉注射100μL B7-1人-鼠嵌合抗体(克隆号2B11)200μg/只,环磷酰胺(CTX)干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15天分别腹腔注射100μL CTX 2.5 mg/只。按照上述时间点分析小鼠抗ds DNA抗体、ANA及尿蛋白含量,12周时处死小鼠观察肾脏组织HE染色、免疫复合物(IC)沉积等情况。结果模型组100%小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为++^++++,抗体干预组12周时仅有30%的小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为+^++;12周时与模型组相比,抗体干预组小鼠血清抗ds DNA抗体阳性率由50%降至0;抗体干预组ANA阳性率由90%降至40%,且荧光面积与荧光亮度均下降;HE染色镜下观察,抗体干预组肾小球囊腔大小较为均一,炎性细胞浸润减少;直接免疫荧光法可见抗体干预组肾小球血管襻IC沉积减少。结论 B7-1人-鼠嵌合抗体可通过阻断或削弱B7/CD28共刺激信号通路,减少自身抗体和IC生成,逆转狼疮肾炎的病理损伤,提示该自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体对狼疮肾炎具有潜在的防治作用。

重组抗人CD22嵌合抗体SM03的^(125)I标记及生物活性

为了探讨125I标记的重组抗人CD22嵌合抗体SM03的生物活性,采用Iodogen法进行单克隆抗体SM03的125I标记,Sephacryl S-300 HR色谱柱分离标记混合物,测定分离后样品的纯度与浓度。采用竞争结合法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定纯化后样品的活性。抗体经过放射性标记后,放化纯度>99%,回收率>47%1。25I-SM03的生物活性与未标记抗体差异没有显著性,P=0.907。用125I-SM03筛选CD22抗原表达量最多的细胞,在Raji、Daudi和Ramos细胞中,SM03与Ramos细胞的特异性结合量最多,每个细胞的结合量为1.3 pmol。以上结果表明,Indogen法可以用于单克隆抗体SM03的标记,标记后不影响SM03的生物活性。

注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的 :通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人 鼠嵌合抗体 2F7Fab片段。方法 :采用RT PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体 2F7杂交瘤中克隆该抗体的重、轻链可变区基因 ,将 2F7单抗的重、轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1 Fab中 ,构建得到pSW1 2F7Fab ,转化受体菌E .coilXL1 Blue ,IPTG诱导表达 ,经Westernblot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果 :从抗人小细胞肺癌单克隆抗体 2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因。测序证实 2F7单抗的重链 (VH)可变区基因全长 36 2bp ,编码 12 0个氨基酸 ;轻链 (VL)可变区基因全长 319bp ,编码10 5个氨基酸。构建的 2F7人 鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达 ,主要分泌在菌液的上清中 ,表达量较高且稳定 ,具有与NCI H1 2 8细胞特异性结合的活性。结论 :构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗 2F7人 鼠嵌合Fab片段 ,表达产物具有与抗原结合的特异性 ,为进一步研究和应用打下了基础。

基因工程抗体的研究

本文综述了本实验室近年来在基因工程抗体方面所做的工作:①从杂交瘤细胞基因组中筛选和鉴定出抗乙型脑炎病毒单克隆抗体的重链、轻链可变区基因,构建成人—鼠嵌合基因并在骨髓瘤细胞中表达出抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体;②根据文献中抗CD3单抗的序列,进行了分子设计,设计出改形抗体的分子序列,用合成和PCR补齐的方法构建了改形的单域抗体(V_H)表达载体,并在大肠杆菌中表达;③构建了外分泌型-附着型的表达单链抗体的表达载体;④克隆和测序了抗人肺腺癌、膀胱癌、CD3的单抗重、轻链可变区基因,并正在构建鼠的抗体库.

重组人-鼠嵌合抗CD20单抗IBI301食蟹猴急性毒性研究

目的:对食蟹猴单次静脉注射重组人-鼠嵌合抗CD20单克隆抗体IBI301,观察其产生的急性毒性反应,为评价药物的安全性及重复给药毒性研究剂量设计和主要观察指标提供参考。方法:实验设溶媒对照组和IBI301给药组,每组2只动物,雌雄各半。给药组动物先给予100 mg·kg^(-1)剂量的IBI301,动物能耐受该剂量,2周后对该组动物单次给予160 mg·kg^(-1)的剂量,溶媒对照组动物也在同一时间再次给予溶媒。实验期间观察动物的临床症状、注射部位刺激性,测定体重、摄食量、体温、心电,进行血液学、血液凝固和血清生化检查、CD20^+/CD40^+细胞测定,二次给药结束后2周对所有实验动物进行解剖和大体病理学检查,对发现的异常病变采集组织样本进行组织病理学检查。结果:食蟹猴分别单次静脉注射100和160 mg·kg-1的IBI301,未引起异常临床症状,未影响食蟹猴摄食量和体重增长,引起外周血B淋巴细胞显著减少或消失、脾脏中度白髓淋巴细胞减少。IBI301对其他检测指标均未见明显影响。结论:食蟹猴能耐受静脉注射160mg·kg^(-1)剂量的IBI301,除观察到与药效作用相关的改变外,未见其他明显的毒性作用。本研究同时为重复给药毒性研究设计提供了重要参考。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体在类风湿关节炎患者体内药动学研究

目的:研究连续静脉滴注重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体(anti-TNF rcMAb)在类风湿关节炎患者体内的药动学。方法:按GCP指导原则设计试验方案,选择9例类风湿关节炎患者,年龄(41±16)岁,在2h内匀速静脉滴注anti-TNF rcMAb,每次3mg·kg-1,共给药5次,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定人血清中各点anti-TNF rcMAb浓度。采用DAS2.1.1软件进行数据处理,计算药动学参数。结果:受试者多次静脉滴注anti-TNF rcMAb,按非房室模型计算,主要药动学参数t1/2为(9.2±1.8)d,Cssmax为(0.008±0.001)mg·L-1,Tssmax为(0.092±0.018)d,AUCss为(248±38)mg.d.L-1,Vss为(0.10±0.08)L·kg-1,DF为(5.5±0.6)。受试者在给药期间未出现严重不良反应。结论:本研究在给药后第3次时血药浓度可达到稳态,连续给药5次后体内未见蓄积,该方案适宜在临床推广使用。建议临床按此方案用药时,使用时间不宜过长,以减少药物不良反应。

重组人-鼠嵌合抗CD20单抗IBI301重复给药毒性研究

目的:对食蟹猴重复给予重组人-鼠嵌合抗CD20单克隆抗体IBI301,考察与参照药的非临床安全性相似性,并为临床设计人用剂量及临床毒副反应的监测提供参考依据。方法:食蟹猴分4组:溶媒对照组、IBI301低剂量组(30 mg·kg^(-1))、高剂量组(90 mg·kg^(-1))和对照品利妥昔单抗组。每组8只动物,雌雄各半。静脉注射给药,每周给药1次,共给药4次。实验期间观察动物的临床症状、注射部位刺激性,进行体重、摄食量、体温、心电、血压、尿检查、眼科学、血液学、血清生化检查,进行外周血和淋巴结CD20^+/CD40^+细胞测定,剖检后进行脏器称重、大体和组织病理学检查。结果:低、高剂量IBI301引起食蟹猴外周血和淋巴结B淋巴细胞显著减少或消失,同时组织病理学检查显示低、高剂量IBI301引起脾脏白髓淋巴细胞数目减少、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结皮质淋巴滤泡数目减少,恢复期结束时上述改变有一定程度的恢复。IBI301 90 mg·kg^(-1)引起食蟹猴血清Ig G水平可逆性升高。IBI301对其他检测指标均未见明显影响。结论:食蟹猴重复静脉注射IBI301 30和90 mg·kg^(-1),除观察到与药效作用相关的改变及引起可逆性的血清Ig G水平升高外,未见其他明显的毒性作用;同剂量IBI301与利妥昔单抗的作用类似。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体对类风湿关节炎患者的疗效及其Th细胞亚群的影响

目的研究重组抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）人鼠嵌合单克隆抗体（anti—TNF rcMAb）对类风湿关节炎（RA）患者治疗效果及对患者外周血Th1、Th17、调节性T细胞影响。方法50例经严格筛选的RA患者按随机分配原则分为2组。联合治疗组（40例），给予anti-TNF rcMAb（3mg／kg）＋甲氨蝶呤治疗；对照组（10例）单独接受甲氨蝶呤治疗，分别于0、2、6、14周给药，于0、18周分别观察联合治疗组与对照组的相关临床指标的变化，在相应观察点做ACR20、50、70评分。同时，对比外周血中Th1、Th17、调节性T细胞的表达情况及相关转录因子T-bet、维甲酸相关孤核受体（ROR）C、叉头状转录因子3（Foxp3）的mRNA表达水平变化。采用t检验和χ^2检验或Ridit作统计学分析。结果治疗前后，联合治疗组ACR20、50、70较对照组均有所改善，尤其ACR20改善程度与对照组相比，差异有统计学意义（Z=1．671，P=0．00094）。联合治疗组患者外周血Th17细胞无显著变化[（0周（1．1±0．6）％；18周（1．1±0．3）％]、Th1细胞比例降低[0周（7．1±3．9）％；18周（4．2±2．8）％]，调节性T细胞比例明显升高[0周（91．5±0．8）％；18周（3．0±0．6）％，t=2．301，P=0．048]；对照组Th1比例下降[0周（9．1±3．1）％；18周（5．8±2．6）％]，调节性T细胞比例略升高[0周（1．2±0．6％）；18周（2．2±0．6）％]。2组Th17、Th1细胞的转录因子RORC、T-bet mRNA表达水平降低，调节性T细胞转录因子Foxp3的表达水平均升高。结论anti-TNF rcMAb联合甲氨蝶呤治疗对RA患者疗效显著，可能通过影响患者外周血Th细胞亚群发挥其治疗作用。

转铁蛋白受体介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV系统的构建及体外效应研究

目的 :构建肝癌靶向性 HSV- tk/ GCV基因转移系统 ,并研究其在体外对肝癌细胞的杀伤效应。方法 :体外培养通过基因重组技术构建和表达抗转铁蛋白受体 ( Tf R)人 -鼠嵌合抗体的转染瘤细胞 D2 C5 .6,诱导裸鼠( Balb/ c,nu/ nu)产生腹水并纯化 ;以蛋白质连接因子 -水溶性碳二亚胺 ( EDC)介导 Tf R的抗体与多聚左旋赖氨酸的连接 ( Ab- PL L ) ,与 p EBAF/ tk按比例混匀 ,得到 Ab- PL L - p ETAF/ tk基因转移系统 ;分别转染不同的细胞株进行体外效应研究 :人肝癌细胞株 Hep G2、SMMC772 1,人肺癌细胞株 5 49,观察给予不同浓度的更昔洛韦 ( GCV)随时间延长的细胞改变情况 ,用 MTT法检测 GCV对不同细胞的杀伤作用。结果 :分析型酸性尿素凝胶电泳证实抗 Tf R的抗体与 PL L成功连接 ;体外杀伤实验显示 :经 Ab- PL L - p ETAF/ tk基因转移系统处理的 3种细胞对 GCV表现出不同的敏感性。 Hep G2细胞 ( CD71 ,AFP )对 GCV很敏感 ,低浓度的 GCV( 1mg/ L )处理 3 d,即可使细胞生长抑制率达到 74.8% ,SMMC772 1细胞 ( CD71 ,AFP+ )对 GCV低度敏感 ,A5 49( CD71- ,AFP- )对 GCV不敏感。结论 :Tf R介导的肝癌靶向性 HSV- tk/ GCV基因转移系统构建成功 ;