基于细胞膜色谱法的新疆准噶尔乌头中抗EGFR活性成分筛选

目的:从准噶尔乌头中筛选抗EGFR作用的活性成分,并考察筛选成分对HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制活性。方法:用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱(EGFR/CMC)通过十通切换阀与高效液相色谱(HPLC)构成二维在线联用色谱系统,将CMC上保留的组分进行接液,用离线MS来鉴定准噶尔乌头中抗EGFR活性成分;利用分子模拟对接实验分析活性成分与受体的相互作用方式;体外用MTT实验证实活性组分对HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制作用。结果:乌头碱、12-表-欧乌碱、准噶尔乌头碱为作用于EGFR的有效成分,并具有与对照药物吉非替尼类似的色谱保留特性;分子模拟对接实验表明这些成分与EGFR的相互作用方式与阳性药吉非替尼相似;MTT实验证实在浓度为0.4~50μmol·L^(-1)范围内乌头碱,12-表-欧乌碱,准噶尔乌头碱对HEK293细胞增殖与EGFR高表达的体外抑制作用具有剂量依赖性。结论:筛选的结果与生物效应相一致;在线EGFR/CMC-HPLC-MS二维色谱系统在中药复杂体系中快速筛选发现活性物和药物先导物方面具有良好的应用前景,同时充分展现了细胞膜色谱法操作简便,快速,高效灵敏的优势。

用高表达EGFR细胞膜色谱-HPLC/MS联用快速筛选独活中抗EGFR活性成分

报道了用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱与高效液相色谱/质谱在线联用方法(EGFR/CMC-online-HPLC/MS)快速筛选发现中药独活中的活性成分.实验中,采用高表达EGFR的细胞膜制备色谱固定相,建立EGFR/细胞膜色谱(EGFR/CMC)模型,利用柱切换和固相萃取技术,将EGFR/CMC模型与高效液相色谱/质谱(HPLC/MS)在线联用,构成一种新的可同时"识别-鉴定"目标成分的二维色谱系统,并应用于快速筛选独活中具有抗EGFR活性的目标成分.结果发现独活中的蛇床子素具有与对照药物达沙替尼类似的色谱保留特性,能够作用于EGFR;同时MTT及Elisa分析实验证实蛇床子素对HEK293EGFR细胞增殖及EGFR表达均有抑制作用.本文建立的EGFR/CMC-online-HPLC/MS二维色谱方法,可以选择性地从中药复杂体系中快速"识别-鉴定"目标组分,且筛选结果与特定生物效应显著相关.

基于SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱的北豆根中潜在抗肿瘤活性组分筛选及验证

目的从北豆根中筛选与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)作用的活性成分,为抗肿瘤药物研究提供新的先导化合物。方法构建SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱模型,将其与高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱构成二维联用系统,靶向筛选北豆根中EGFR的潜在抗肿瘤活性组分。用前沿分析和计算机模拟分子对接研究潜在活性组分与EGFR的相互作用。并用细胞增殖抑制实验初步验证潜在抗肿瘤活性组分的药理作用。结果利用该二维联用系统从北豆根提取物中识别出目标组分蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱。前沿分析测得蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱与EGFR相互作用的平衡解离常数K_(D)值分别为2.48×10^(-6)、3.57×10^(-6)mol·L^(-1),表明蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱与EGFR均存在一定强度的相互作用关系。分子对接实验表明蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱均可结合于EGFR的活性腔,与EGFR的氨基酸残基形成氢键。细胞增殖抑制实验结果显示,蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱在5~100μmol·L^(-1)范围内能够剂量依赖地抑制SNAP-tag-EGFR/人胚肾细胞293(human embryonic kidney 293,HEK293)的增殖,当给药浓度为50μmol·L^(-1)时,蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞生长的抑制率可达到80.59%±3.74%、73.70%±6.93%。结论SNAP-tag-EGFR/CMC模型和高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用为在天然产物中快速寻找先导化合物提供了平台,为中药活性组分的作用机制研究奠定了基础。