抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化

目的:优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。方法:通过测定宿主菌培养物A600值观察10g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响;比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量;比较在37℃和25℃2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。大量表达的功能性hFab-HB1分子经亲和层析纯化后,用ELISA鉴定其生物活性。结果:在培养液中加入10g/L的葡萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达,增加宿主菌的生长速度;在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量;25℃的诱导温度比37℃能表达更多的功能性Fab分子,并且Fd和轻链表达量也更趋于平衡。经亲和层析纯化的hFabHB1分子可与HBsAg特异性结合。结论:实验结果为在原核系统中大量表达该抗体片段提供了技术储备。

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P .pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)。设计引物从pGEM HBscFv上扩增目的基因 ,亚克隆至P .pastoris表达载体pPICZαA中 ,线性化后转化P .pastorisGS115 ;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后 ,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现 ,重组HBscFv可以在α因子的引导下 ,分泌至培养基中 ,产量为80mg L ;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性 ,活性总量在诱导培养 72h后达最高峰 ,在诱导培养后期 ,HBscFv活性下降 ;PAS糖显色结果表明 ,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的 :纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法 :以原核表达的重组人源性抗HBsscFv免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株 14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水 ,经辛酸沉淀纯化后 ,制备亲和层析柱 ,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体。结果 :用抗scFvmAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达 95 %以上 ,回收率可达 70 %～ 85 %。结论 :人源性抗HBsscFv制备mAb作为亲和层析的介质 ,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAgFab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAgFab。

人源抗HBsAg抗体Fd段和L链高效表达菌株的筛选

目的 :选用高效表达载体分别高效表达人源抗HBsAg抗体的Fd段和L链 ,经包涵体纯化和变性复性使Fd段和L链之间形成二硫键 ,最终制备有活性、高产量的人源抗HBsAg基因工程抗体Fab。方法 :用PCR法从可溶性表达重组质粒抗HBsAgFadComb3扩增Fd段和L链后分别构建高效表达载体PQE32 Fd和PQE32 L ,并分别导入大肠杆菌M15中进行表达 ,用SDS PAGE筛选出高效表达克隆。结果 :SDS PAGE筛选的高效表达克隆M15 PQE32 Fd和M15 PQE32 L经IPTG诱导后以包涵体形式表达 ,其表达量很高。从高效表达克隆重新扩增Fd段和L链后进行测序鉴定发现所得的序列与已报道的抗HBsAg抗体Fab基因吻合率为 97%。结论 :虽然已有表达可溶性人源抗HBsAg基因工程抗体Fab的报道 ,但因其表达量低而不能实际应用。筛选出高效表达人源抗HBsAg抗体Fd段和L链的克隆 ,因为包涵体形式表达需经变性复性 ,虽然变性复性后其产量会受影响 ,但因表达量很高 ,所以还是有很高的实际应用价值。其包涵体变性复性条件仍需进一步探讨。

人源抗HBsAg单链抗体与干扰素嵌合基因的构建及表达

采用重叠PCR技术 ,将人源性抗HBsAg单链抗体基因与干扰素 γ 基因用柔性肽段碱基连接成单一基因 .序列测定结果表明 ,克隆的基因与理论上的一致 ,并将此基因成功构建到酵母表达载体pPICZαA上 ,进而转化到巴斯德毕赤酵母 (PichiaPastoris)X33中 .筛选出的菌落经甲醇诱导培养 ,对上清液进行SDS PAGE和WESTERNBLOT分析 ,在 4 20 0 0处可见蛋白表达带 。

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体(摘要)

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。方法:用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。材料:①SB培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨30g,酵母提取物20g,Mops 1g,pH7.0。②SOC培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨20g,酵母提取物5g,NaCl 0.5g,250mmol/L KCl溶液10ml,pH7.0。临用前加入2mol/L MgCl2溶液5ml和1mol/L葡萄糖溶液20ml。③血源纯化HBsAg。

重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨保护的影响

目的:观察重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效、骨保护的影响,为类风湿关节炎治疗提供更多、更积极手段。方法:选取2019年9月—2020年9月萍乡市人民医院门诊及住院就诊、确诊类风湿关节炎患者120例,按照随机数字表法分组,分为对照组和观察组。对照组为安慰剂(淀粉)+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d;观察组为重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体注射液+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d,对比疗效、关节肿胀、关节压痛、骨密度、骨钙素等成果。结果:治疗3个月后,观察组的临床总有效率高于对照组(P<0.05),红细胞沉降率、类风湿因子均低于对照组(P<0.05),观察组骨密度T值、骨钙素均优于对照组(P<0.05)。观察组关节肿胀、关节压痛个数均少于对照组,观察组VAS评分及DAS28均低于对照组(P<0.05)。在治疗期间不良反应发生率上,观察组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在甲氨蝶呤及稳定剂量泼尼松≤10 mg/d基础上,采用重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎具有良好的临床疗效,还有助于改善骨保护、骨密度指标,同时不良反应较少。

重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨代谢的影响

目的:探讨重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎(RA)临床疗效及骨代谢的影响。方法:选取2019年8月—2022年3月于萍乡市人民医院就诊并确诊RA患者60例,按随机数字表法将患者分为治疗组和对照组,各30例。治疗组采用重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗,对照组采用甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗。于治疗前和治疗3、6个月检测两组患者机体的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、骨钙素(OC)、骨密度,评估两组患者的视觉模拟评分法(VAS)评分、Sharp评分及安全性。结果:两组治疗3、6个月的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、VAS评分均明显低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月上述指标均明显低于对照组(P<0.05)。两组治疗3、6个月的OC均高于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月OC均高于对照组(P<0.05);两组治疗前后股骨颈骨密度组间和组内比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组治疗3、6个月的Sharp评分均低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月的Sharp评分均低于对照组(P<0.05)。治疗组不良事件发生率虽高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体可有效降低RA患者的C反应蛋白、类风湿因子及血沉水平,缓解其疼痛,升高OC,降低Sharp评分,且不会增加不良事件的发生,安全性较高。

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的 :探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素 2融合蛋白在巴氏毕赤酵母 (P .Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法 :用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf(+) HBScFv IL 2上扩增出来 ,再亚克隆到酵母表达载体pPICZаA中 ,转化P .Pastoris宿主菌GS 115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,重组酵母经甲醇诱导后 ,通过SDS PAGE及Western blot分析鉴定表达产物 ;再通过亲和层析法纯化目的蛋白 ;用间接ELISA实验鉴定其活性。结果 :表达的重组蛋白分子质量约为 4 4ku ,表达量可达 12 % ;纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95 % ;重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL 2单克隆抗体特异性结合。结论 :成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL - 2融合蛋白酵母表达工程菌 ,并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ 抗体的轻链（Ｌ）和重链Ｆｄ 段基因，分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ 质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处有外源蛋白表达，表达蛋白含量分别为５３％ 和４８％ 。Ｌ链和Ｆｄ 包涵体蛋白经盐酸胍变性后，等量混合于折叠液中，Ｌ和Ｆｄ 可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。ＥＬＩＳＡ结果表明，复性蛋白具有与ＨＢｓＡｇ 结合的能力。抗ＨＢｓＡｇ 抗体Ｆａｂ 段在大肠杆菌中的表达与复性的成功，表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的。

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 。

HBsAg和抗HBs抗体同时阳性患者病毒学特征分析

目的分析HBsAg和抗HBs抗体同时阳性的HBV感染者病毒学特征及其临床意义。方法总计13 080例HBsAg阳性病例中,HBsAg与抗HBs抗体同时阳性476例,分析资料完整的113例患者(研究组)HBV血清标志物(HBVM)和HBVDNA定量、抗HBc IgM抗体及ALT结果,并与76例普通HBV感染者(对照组)进行比较。结果研究组与对照组在年龄、男女性别比及HBeAg阳性率间差异无统计学意义。研究组HBsAg水平显著低于对照组(P<0.05)。研究组抗HBc IgM抗体阳性率为30.9%,抗HBc IgM抗体阳性患者的血清HBsAg与HBV DNA水平、HBeAg阳性率及ALT水平均显著高于抗HBc IgM抗体阴性患者(P<0.05)。结论 HBsAg与抗HBs抗体同时阳性感染者HBsAg水平显著低于普通感染者,提示患者体内的抗HBs抗体可能仍起到一定作用;约30%患者可能处于HBV急性发作状态,应对其进行随访,观察疾病转归。

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。

抗人BPI抗体对猪源BPI体外生物活性的增强作用

目的 确认抗人杀菌性 通透性增加蛋白 (Bactericidal permeabilityincreasingprotein ,BPI)多克隆抗体和单克隆抗体对猪源BPI杀菌及结合内毒素活性的增强作用。方法 采用肉汤培养法测定BPI在有或无抗人BPI抗体存在情况下猪源BPI对大肠杆菌J5的杀菌率变化 ;采用鲎基质显色法测定BPI与抗体孵育 30min后其结合内毒素能力的改变。结果 抗人BPI多克隆抗体和单克隆抗体加入后 ,猪源BPI的杀菌活性不仅不降低 ,反而增加 ,而抗体本身并不具有杀菌性 ,非抗BPI抗体也无此效应 ;同时抗人BPI多克隆抗体和单克隆抗体可增加猪源BPI的结合内毒素活性。结论 抗人BPI多抗或单抗不仅能增加猪源BPI的杀菌活性 。

人源抗滋养层细胞表面抗原-2基因工程抗体Fab的制备及特性分析

应用噬菌体抗体库技术制备全人源抗滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)特异性Fab抗体片段.抗体库经细胞筛选和固相抗原筛选,获得特异性的阳性克隆.阳性载体经核酸序列分析后,构建工程菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,呈现28ku和32ku大小的两条蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与BxPc3细胞膜蛋白特异性结合,而与NIH3T3细胞不结合.免疫共沉淀与质谱分析结果表明,该Fab分子能够与Trop-2蛋白特异性结合.免疫组化显示,该抗体可结合胰腺癌细胞膜蛋白,在细胞培养液中加入Fab,能够抑制BxPc3细胞的生长.以上研究结果提示,该抗体有望成为胰腺癌临床影像诊断或治疗的候选分子.

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的纯化

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ５Ｂ１２发生反应。

ECLIA与ELISA法检测献血者HBsAg、抗-HCV和HIV抗原/抗体的一致性分析

目的探讨电化学发光免疫分析法(ECLIA)在献血者血液检测中的应用模式。方法以2016年12月—2017月11月东莞市中心血站33 493(人)份献血者血液标本为研究对象,先用ELISA法:分别用2种不同厂家的HBs Ag试剂(B1和B2)、抗-HCV试剂(C1和C2)和HIV抗原/抗体试剂(I1和I2)检测2遍;2017年7月前主要挑选任1次ELISA(试剂)检测结果为'S/CO≥0. 3'的标本做ECLIA检测(挑选模式),7月后所有标本平行检测(不挑选模式),分析ECLIA与ELISA(试剂)检测结果的一致性;比较ECLIA'挑选模式'和'不挑选模式'中ELISA无反应性标本(S/CO<0. 9)的ECLIA阳性检出率,评价ECLIA作为补充检测模式的效果。结果 ECLIA与2种ELISA(试剂)检测献血者3项血液学指标结果一致性与阳性检出率:HBs Ag一致性极好(К≥0. 9),阳性率分别为2. 894%(322/11 127)与2. 642%(B1:294/11 127)、3. 020%(B2:336/11 127)(P>0. 05);抗-HCV一致性较高(К>0. 6),阳性率分别为0. 395%(67/16 978)与同为0. 224%(C1和C2相同:38/16 978)(P<0. 01);HIV抗原/抗体一致性较差(0. 3<К<0. 4),阳性率分别为0. 499%(69/13 837)与0. 238%(I1:33/13 837)、0. 289%(I2:40/13 837)(P<0. 01)。ECLIA'不挑选'与'挑选'2种检测模式的阳性率比较:HBs Ag为0. 07%(4/5 678) vs 0. 441%(22/4 988)(P<0. 01),抗-HCV为0. 169%(28/16 528) vs 1. 176%(4/340)(P <0. 01),HIV抗原/抗体为0. 377%(51/13 542) vs 0. 649%(1/154)(P>0. 05)。结论在献血者血液筛查中,ECLIA与ELISA的HBs Ag和抗-HCV检测结果一致性好,HIV抗原/抗体的结果一致性较差;'挑选模式'中HBs Ag和抗-HCV的ECLIA阳性检出率较高,ECLIA的应用模式有待进一步研究。