抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的 :重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体 (anti NI 35 scFv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据抗NI 35抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到克隆载体 pUC 18中 ,经全自动序列分析仪测序证实 ,再亚克隆至表达载体 pET 2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,诱导表达。 结果 :合成的基因序列与设计的仅差一个碱基 ,目的基因连接方向及阅读框架正确 ;SDS PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 31kDa的融合蛋白 ,并得到了良好的生物活性。结论 :抗NI 35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达 。

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体(anti NI 35 scfv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。认为抗NI 35重组单链抗体 (IN 1 scFv)基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究anti NI 35 scFv应用于神经系统损伤和修复奠定了基础。

抗NI-35重组单链抗体基因cDNA的合成与克隆

目的抗NI-35抗体(anti-NI-35antibody)作为神经再生抑制因子(NI-35)的拮抗剂对神经再生促进作用的研究是近年的热点,研究表明,抗NI-35抗体能促进体内外受损伤神经元的存活和突起生长。我们重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scfv)的cDNA克隆构建其表达载体,在原核系统中实现初步表达。方法参照genebank中发表的抗NI-35抗体的轻链重链序列,重新设计适于在大肠杆菌中表达的目的基因片段,将该基因双链分成35个小片段合成,经退火、复性连接成目的片段后,克隆到经过BamHI和HindIII双酶切的克隆载体pUC18中,并转化大肠杆菌DH5a,抽提重组子pUC18/744进行克隆PCR、酶切鉴定及测序分析。结果测序结果证明获得的基因序列与实验设计仅差一个碱基。结论正确合成了抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-single-chainantibody)为抗NI-35抗体应用于治疗弥漫性轴索损伤提供了实验基础。

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,对其产物作初步鉴定 ,为肝癌的导向治疗奠定基础。方法 :采用分子克隆技术 ,PCR法扩增PE38基因片段 ,克隆入GST -融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ,受IPTG诱导表达后 ,SDS -PAGE及Westernblot分析GST融合蛋白结果。结果 :成功构建免疫毒素表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv -PE38(以下简称pGEXh -PE38) ;SDS -PAGE清晰显示Mr为 90 0 0 0的目的蛋白条带 ,光密度薄层扫描提示表达量为 11% ,Westernblot在相同位置显示蛋白印迹 ,证实载体构建及表达均正确。结论 :利用基因重组技术 ,在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv -PE38。

抗胃癌单链抗体免疫毒素重组质粒的构建及表达

目的 构建能表达抗胃癌单链抗体免疫毒素的重组质粒并进行表达。方法 应用基因工程方法 ,将抗胃癌的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素基因进行重组 ,得到的重组质粒转化大肠杆菌BL - 2 1,鉴定后的阳性克隆经IPTG诱导表达。结果 重组质粒经酶切鉴定正确 ,IPTG诱导后可看到明显的表达带 ,分子大小与预计值相符。结论 得到了能表达抗胃癌单链抗体免疫毒素的重组质粒。

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 。

表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体复性方法探索

探索表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体(Anti-CTLA4-scFv)的体外复性方法.采用稀释和透析两种复性方式,并分析影响复性得率的各种因素如复性时间、温度、适宜的氧化-还原体系对其的影响.通过非还原电泳确定复性效果,并测定蛋白含量.结果显示:含0.15 mol·L-1NaCl、1 μmol·L-1氧化型谷胱甘肽和3μmol·L-1还原型谷胱甘肽的50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液作为Anti-CTLA4-scFv的复性液,4℃下透析复性48～54 h,可获得具有天然构象的蛋白质.该方法复性蛋白得率高,从3.9 g菌体中可复性获得28 mg蛋白.

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株 (2D1 ,3F8)中克隆出VH 和VL 基因 ,然后利用重组PCR技术 ,将VH 和VL 基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3 的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv) ,将ScFv克隆到表达载体 pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coliHB2151及TG1 中进行表达。结果SDS PAGE和Western blot分析表明 ,ScFv在大肠杆菌E.coliHB2151中得到了分泌表达。间接ELISA结果显示可溶性ScFv及其表面展示噬菌体均具有抗原结合活性。结论成功地获得了ScFv 2D1和ScFv 3F8基因并在大肠杆菌中得到了功能性表达 ,为新型抗菌肽的设计打下了基础。

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定

目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6 B11Sc Fv和鼠 GM- CSF融合蛋白 (6 B11m GM) ,以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应 ,为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据。 方法 用 DNA重组技术 ,将m GM- CSF连于单链抗体 6 B11Sc Fv羧基末端 ,构建重组质粒 p ET30 - 6 B11m GM,转化大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,IPTG诱导 ,以包涵体形式获高效表达 ,超声破碎细菌细胞获得包涵体 ,用 8mol.L- 1尿素溶解包涵体后直接稀释复性 ,SDS- PAGE分析蛋白纯度 ,EL ISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。 结果 复性蛋白纯度达 90 %以上。采用氧化型谷胱甘肽 (GSSG)浓度为 1mm ol.L- 1 ,还原型谷胱甘肽 (GSH)浓度为 5 m mol.L- 1 ,10℃复性 48h,复性率达 36 %。表达的融合蛋白分别能与 COC16 6 - 9单抗和大鼠抗小鼠 GM- CSF单抗特异结合 ,并能刺激 m GM- CSF依赖株 NFS- 6 0细胞增殖。 结论 以包涵体表达的融合蛋白 6 B11m GM保留了两种蛋白的活性 。

抗CD_3单链抗体基因克隆与表达

采用重叠延伸拼接法 (SOE)连接抗CD3 抗体的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VK)基因 ,构建单链抗体基因 (ScFv)并将其克隆于含Tac启动子质粒中 ,用斑点杂交法筛选出重组子 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )

抗胃癌单链抗体免疫毒素的制备及活性检测

目的 对抗胃癌单链抗体免疫毒素基因重组质粒进行表达 ,进而获得有活性的单链抗体免疫毒素。方法 应用IPTG诱导大肠杆菌表达系统进行单链抗体免疫毒素基因重组质粒的表达 ,并对产生的不溶性包涵体进行纯化 ,经变性、复性后 ,观察其生物学活性。结果 诱导表达了约 6 6KD的蛋白 ,分子量符合预计大小 ,以包涵体的形式存在于菌体中。经包涵体纯化、变性、复性 ,使其折叠为正确的空间结构 ,经检测可与胃癌细胞MGC80 3特异结合 ,并有一定的细胞毒性。结论 获得了可与胃癌细胞系MGC80 3特异结合 。

毒素共轭化合物法筛选表达重组抗体的大肠杆菌细胞

半抗原-毒素共轭体的毒性可因抗体或其它可与之结合的物质所产生的空间位阻作用而被中和。如使用抗荧光素抗体B13-DE1和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）结合到相应的共轭化合物——荧光素-氨苄西林和生物素-氨苄西林后，这两种化合物对E．coli细胞的生长抑制作用被中和，采用这一方法可从大量细胞中筛出表达单链抗体片段或其他结合分子的大肠杆菌细胞。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究

目的 研究重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用 ,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性。方法 工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后 ,分步透析复性。复性后的HBscFv(0 .9g L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠 ,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度 ,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比 (结合率 ) ,同时以人血源HBsAbIgG(40U ml)和生理盐水作为对照。结果 两步纯化获得纯度达到 98%的重组HBscFv。HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为 (30 .4 7± 9.85 ) % ,与生理盐水组差异有显著性 (P <0 .0 0 1) ,与HBsAbIgG组差异无显著性(P >0 .0 5 ) ;对照品HBsAbIgG的结合率为 (39.0 0± 7.4 3) % ,与生理盐水组差异也有显著性 (P <0 .0 0 1)。比较HBscFv和HBsAbIgG的结合率及其浓度 ,求得HBscFv的结合效价为 31.5 8U mg。结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性 ,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型。