犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

抗TL1A单克隆抗体通过影响巨噬细胞极化减轻结节病肉芽肿形成的机制研究

目的 探讨抗TL1A单克隆抗体是否可通过影响结节病中巨噬细胞的极化水平,减轻结节病肉芽肿的形成。方法 采用随机分组法将32只C57BL/6小鼠分成空白对照组、结节病组、结节病+TL1A Ab治疗组和结节病+地塞米松治疗组(n=8)。通过肺组织病理学染色(HE染色)观察各组小鼠肺部肉芽肿的形成;通过流式细胞术检测各组小鼠脾脏单个核细胞(PBMC)中M1/M2型巨噬细胞的水平。提取各组小鼠股骨和胫骨内的原代骨髓源性巨噬细胞(BMDM),培养并分别诱导各组BMDM向M1或M2型巨噬细胞方向分化,使用流式细胞术与qPCR分别测定各组小鼠BMDM中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞数目和相关因子的mRNA表达情况。结果 与结节病组相比,结节病+TL1A Ab组小鼠肺组织中肉芽肿的数目明显减少(P<0.001)。相较于空白对照组,结节病组PBMC中M1型巨噬细胞水平增高(P<0.001),给予TL1A Ab后可逆转这一现象(P<0.001);结节病+TL1A Ab组PBMC中M2型巨噬细胞的水平高于结节病组(P<0.001)。各组小鼠BMDM经诱导分化后,结节病+TL1A Ab组M1型巨噬细胞极化水平较结节病组下降(P<0.001);而TL1A Ab组M2型巨噬细胞极化水平高于结节病组(P<0.001)。结论 抗TL1A单克隆抗体通过调控结节病中巨噬细胞的极化水平而抑制结节病中的肉芽肿性炎。

肝动脉灌注化疗联合抗PD-1抗体及仑伐替尼治疗不可切除肝细胞肝癌临床研究

探讨肝动脉灌注化疗联合抗PD-1抗体及仑伐替尼治疗不可切除肝细胞肝癌临床研究。方法 选取2022年10月-2023年9月我院收治的不可切除肝细胞肝癌患者200例,分为两组,对照组选择肝动脉灌注化疗治疗,研究组选择肝动脉灌注化疗联合抗PD-1抗体及仑伐替尼治疗。结果 与对照组比,研究组的治疗有效率更高且不良反应发生率更低(P<0.05);研究组的肿瘤标志物水平更低(P<0.05);研究的肝外转移率、肝内复发率更低且生存率更高(P<0.05)。结论 肝动脉灌注化疗联合抗PD-1抗体及仑伐替尼治疗不可切除肝细胞肝癌的效果更加显著,能够有效抑制肿瘤增长,改善肿瘤标志物水平,减低复发率和不良作用发生率,提高生存几率,值得推广。

PD-1抗体与抗血管生成药物分别联合化疗治疗晚期驱动基因阴性肺腺癌的近远期效果对比

目的:比较程序性细胞死亡受体-1(PD-1)抗体与抗血管药物分别联合化疗治疗晚期驱动基因阴性肺腺癌的近远期效果。方法:选取118例晚期驱动基因阴性肺腺癌患者为研究对象,根据不同治疗方式将PD-1抗体联合化疗的患者纳入A组(n=60);将抗血管生成药物联合化疗的患者纳入B组(n=58)。观察两组患者临床近期疗效,毒副反应,免疫功能和预后分析。结果:治疗后,A组患者近期临床疗效的客观有效率(ORR)、疾病控制率(DCR)和疾病无进展期(PFS)明显高于B组(P<0.05);两组患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均上升(P<0.05),且A组高于B组(P<0.05);CD8^(+)水平均降低,且A组低于B组(P<0.05);A组患者和B组患者治疗期间毒副反应发生率无统计学差异(P>0.05)。结论:PD-1抗体联合化疗治疗晚期驱动基因阴性肺腺癌患者临床疗效更好,有助于恢复免疫功能,且毒副反应少,具有良好的安全性,有助于延长PFS,值得临床推广应用。

抗猪PD-L1分子的单克隆抗体制备及免疫学特性分析

为制备抗猪程序性死亡因子配体1(PD-L1)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其免疫学特性,本研究将猪PD-L1基因的外膜区利用原核表达载体pET32a进行表达,以纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以表达PD-L1-Fc蛋白的293T细胞作为抗原,采用间接免疫荧光试验筛选杂交瘤培养上清,获得两株稳定分泌抗猪PD-L1 MAb的杂交瘤细胞系。MAb亚型鉴定均为IgG1型,轻链为κ链。Western blot试验表明这两株MAb均可以特异性识别PD-L1蛋白。流式细胞检测结果显示这两株MAb可以识别表达于293T细胞膜表面的PD-L1分子,但不能阻断PD-L1分子与其受体PD-1的结合。这两株MAb的获得为研究PD-1/PD-L1通路与猪的某些感染性疾病发展进程的关系提供了必要的检测工具。

疲劳症状管理方案在肺癌抗PD-1抗体免疫治疗期间的应用效果

目的:探讨疲劳症状管理方案在肺癌抗PD-1抗体免疫治疗期间中的应用效果。方法:选取医院肺癌抗PD-1抗体免疫治疗病人94例为研究对象,应用随机数字表法将病人分为观察组及对照组各47例。对照组治疗期间行常规护理,观察组实施疲劳症状管理方案,比较两组干预前后癌因性疲乏感、症状、心理弹性及生活质量。结果:干预后观察组癌因性疲乏感评分及安德森症状评估量表(MDASI)评分明显低于对照组(P<0.05),而观察组干预后心理弹性评分及肺癌治疗功能性量表(FACT-L)相关维度评分较对照组明显提升(P<0.05)。结论:疲劳症状管理方案能有效减轻肺癌抗PD-1抗体免疫治疗期间癌因性疲乏感及疾病不确定感,可提升病人心理弹性水平,改善病人生活质量。

定量检测PD-1单克隆抗体ELISA法的建立

目的建立一种高特异、高灵敏、新型的定量检测食蟹猴血清中PD-1单克隆抗体质量浓度的ELISA方法。方法用重组人PD-1作为抗原包被到96孔板上,加入系列浓度标准品(PD-1单克隆抗体)和稀释的食蟹猴血清,再加入稀释的猴血清吸附的羊抗人Ig G-HRP(二抗),二抗与结合到抗原上的PD-1单克隆抗体特异性结合,加入底物显色剂,用硫酸终止,在450 nm下读数。结果在40~0.625 ng/ml范围内,PD-1单克隆抗体质量浓度的对数值与吸光值呈S形曲线,方法灵敏度为0.625 ng/ml,TNF-α、r HSA、PEG-GH和受试品PD-1单克隆抗体均无交叉反应,方法的回收率为94.5%~98.0%,板内精密度波动在-4.1%^-0.1%,板间精密度波动在-5.0%^-1.0%。结论本方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则的要求,可用于食蟹猴体内PD-1单克隆抗体的定量检测。

鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。

两株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:制备鼠抗人PD-1单克隆抗体(mAb)及鉴定其生物学特性。方法:以基因转染细胞PD-1/L929为免疫原,免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选分泌鼠抗人PD-1分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、Western blot、竞争结合抑制试验及肿瘤细胞株测定等方法对mAb进行生物学特性鉴定。结果:获得了2株持续稳定分泌鼠抗人PD-1mAb的杂交瘤细胞株,命名为1F2和5F10。对其生物学特性的鉴定结果表明,均为条带相对分子质量在(Mr)55000左右的免疫球蛋白,具有不同的PD-1结合位点;1F2mAb可识别SKHep-1和7721细胞株表面的PD-1分子,而5F10可识别Raji细胞株的PD-1分子。结论:成功获得了2株鼠抗人PD-1杂交瘤及其分泌的mAb。

抗PD-1抗体联合治疗晚期肝细胞癌的真实世界研究

目的探讨真实世界中以抗PD-1抗体为基础的疗法在晚期肝细胞癌治疗中的疗效、不良反应及可能影响疗效的因素。方法收集55例接受以PD-1抗体为基础治疗的晚期肝细胞癌患者,回顾性分析其临床特点、疗效及不良反应,并进行随访。结果客观有效率为21.8%,疾病控制率为76.4%。治疗过程中不良反应整体发生率为81.8%,其中3~4级不良反应发生率为14.5%,免疫相关不良反应发生率为58.2%,其中3~4级免疫相关不良反应发生率为3.6%,无治疗相关死亡。55例患者中位无进展生存期为5.0月(95%CI:3.9~6.1),中位生存期11.4月(95%CI:6.5~16.3)。应用抗PD-1抗体前患者肝功能Child-Pugh评分和体能状态ECOG评分是影响治疗有效率和生存时间的主要因素;多因素分析也表明治疗前患者的体能状态ECOG评分和肝功能Child-Pugh评分是影响患者生存的独立预后因素(P<0.001,P=0.034)。结论真实世界中以PD-1抗体为基础的治疗在晚期肝细胞肝癌患者中是安全有效的,其中治疗前患者的体能状态ECOG评分和肝功能Child-Pugh评分是影响患者生存期的独立预后因素。

靶向PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂研究进展

目的:阐述PD-1/PD-L1的相互作用机制及其在癌细胞免疫逃逸上的作用,并介绍近几年开发的靶向PD-1/PD-L1的新型小分子抑制剂。方法:检索国内外PD-1/PD-L1抑制剂的文献,整理和比较近几年开发的靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂。结果:PD-1/PD-L1抑制剂主要包括单克降抗体、拟肽抑制剂和小分子抑制剂,主要通过阻断PD-1/PD-L相互作用,形成PD-L1二聚体发挥作用。意义:开发靶向PD-1/PD-L1的小分子药物是一个具有挑战性的过程,小分子抑制剂具有比抗体更好的抑制肿瘤生长和迁移的能力,近几年小分子抑制剂的设计思路为小分子抑制剂的设计提供了新的思路。

型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb)。方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白。非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性。间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价。mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类。结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3。2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1∶800;小鼠腹水中抗体效价为1∶12800。亚类鉴定结果为IgG1κ。Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应。结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型L1蛋白表达及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的表达并纯化重组人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白，建立分泌抗HPV16 L1单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。方法以基因工程表达HPV16L1蛋白。用Ni—NTA技术进行纯化后免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，经含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的选择培养基及有限稀释法进行克隆化，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，对获得的杂交瘤细胞株染色体进行计数．同时测定细胞培养上清mAb的效价。结果筛选出2株可分泌抗HPV16 L1 mAb的杂交瘤细胞，命名为AE3和AG7，染色体数分别为130条和98条。2株杂交瘤细胞AE3和AG7培养上清的效价分别为1：5120和1：80。结论成功建立了2株可分泌抗HPV 16 L1 mAb的杂交瘤细胞，为进一步研制HPV感染检测试剂盒提供实验基础。

一株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:制备鼠抗人PD-1单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:以稳定表达人PD-1分子的基因转染细胞株L929/PD-1免疫BALB/c小鼠,采用流式细胞术筛选分泌鼠抗人PD-1单抗的杂交瘤细胞株。用Ig G亚型快速定性试纸法、肿瘤细胞株表面PD-1分子识别谱检测、抗体效价测定、竞争结合抑制实验和蛋白质印迹等方法对所获PD-1单抗的生物学特性进行分析鉴定。结果:获得1株持续稳定分泌PD-1单抗的杂交瘤细胞株,命名为6E1。单抗6E1的重链为Ig G1、轻链为κ。单抗6E1对肿瘤细胞株U937、Thp-1、Jurkat细胞表面PD-1分子的识别谱与商品化PD-1单抗MIH4一致。单抗6E1与商品化抗体MIH4具有相似的识别位点。蛋白质印迹检测结果表明单抗6E1可特异性识别PD-1分子。结论:成功获得了1株鼠抗人PD-1单克隆抗体。

抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1(rFgCat L1)特异性单克隆抗体,并构建其双抗体夹心ELISA检测方法。【方法】用1 mg/mL rFgCat L1蛋白分4次对5只BALB/c小鼠进行免疫,分离小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合构建杂交瘤细胞,筛选强阳性杂交瘤细胞株,每只小鼠腹腔注射1×10^(6)个细胞制备单克隆抗体。ELISA法检测抗体效价及抗原表位,Western blotting法鉴定抗体亚型和特异性;结合抗rFgCat L1多克隆抗体构建双抗体夹心ELISA检测方法,并检测其敏感性和特异性;用建立的方法对20份阴性血清及阳性血清对照进行检测,筛选其阴阳临界值,并用47份山羊阳性血清及47份奶牛阳性血清对所构建的双抗体夹心ELISA方法进行验证。【结果】免疫后,4只小鼠血清中抗体效价均>10^(4);取小鼠脾细胞与SP2/0融合后,共筛选到8株阳性杂交瘤细胞株,其中5D5和7G6为可稳定分泌抗体的强阳性株,抗体效价分别达2^(9)和2^(10),腹水效价分别达10^(7)和10^(8)。经Western blotting鉴定2株抗体均为IgG1型,轻链为Kappa型,均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretory product,ESP)。由于2株抗体识别相同抗原位点,对比2株单抗的抗体效价,选择以7G6作为捕获抗体,抗rFgCat L1多克隆抗体作检测抗体构建双抗体夹心ELISA法。双抗体夹心ELISA法条件为:7G6以2μg/mL浓度包被,抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶4000,5%脱脂奶粉封闭,显色时间为25 min。经验证,该方法可识别的最低抗原浓度为0.625μg/mL,并且可特异性识别大片形吸虫抗原。利用构建的双抗体夹心ELISA方法对阳性的奶牛和山羊血清样本进行抗原检测,抗原检出率分别为72.3%及78.7%。【结论】本研究成功制备抗rFgCat L1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法,结果可为研发低成本、快速诊断试剂盒提供良好的理论依据及物质基础。

基于WHO-VigiAccess的5种PD-1/PD-L1单抗不良反应特点分析

目的比较程序性细胞死亡蛋白受体1(PD-1)及其配体1(PD-L1)靶点的单抗抗癌药药品不良反应(ADR)的特点,为临床安全用药提供参考依据。方法提取世界卫生组织药品不良反应报告数据库(WHO-VigiAccess)中替雷利珠单抗、帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、度伐利尤单抗和阿替利珠单抗自发ADR报告数据,时间截至2021年,对5种单抗ADR症状的报告比例、ADR的共同点和差异性进行比较。结果获得5个单抗ADR报告数共105004份。5个单抗的ADR常发生在胃肠系统疾病系统,至少有3个单抗的ADR常发生于呼吸系统、胸及纵隔疾病,感染及侵染类疾病和皮肤及皮下组织类疾病系统。度伐利尤单抗在呼吸系统、胸及纵隔疾病,阿替利珠单抗在各类神经系统疾病,纳武利尤单抗在内分泌系统,替雷利珠单抗在心脏器官疾病系统的ADR报告比例明显高于其他药品。5个单抗的常见ADR症状有腹泻、呕吐、恶心、感染性肺炎、呼吸困难。除替雷利珠单抗外,4个单抗还常见结肠炎、瘙痒、食欲下降、关节痛、咳嗽、甲状腺功能异常的症状。度伐利尤单抗发生肺部炎症和纳武利尤单抗发生2型糖尿病症状的情况尤为突出。纳武利尤单抗死亡案例报告比例最高。在多个单抗中出现低血压和心肌炎等新的ADR症状。结论5个PD-1/PD-L1单抗常见的ADR涉及疾病系统和具体症状基本与药品说明书一致,但也存在一些特异性的和新发的ADR症状。应依据PD-1/PD-L1单抗的ADR特点,提高合理用药水平。

HPV16 L1／L2蛋白单克隆抗体的制备

用真核表达的ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白作为抗原，经免疫、融合、选择性培养、克隆化等过程，我们建立了两株抗ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白的杂交瘤细胞株（另有数株仍在建株中）。免疫斑点法检测证明，它们产生的抗体，只与ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白起反应，而不与ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７蛋白、人血清蛋白和牛血清蛋白起反应。另外，免疫组化试验证明，这种抗体可应用于临床ＨＰＶ１６感染的检验，具有敏感、特异、准确、快捷、经济的优点。

PD-1/PD-Ls信号通路及其抗体在肿瘤治疗中的应用

程序性死亡受体-1(PD-1)是T细胞上主要存在的一种抑制性受体,与其配体PD-L1、PD-L2相互作用,可抑制T细胞增殖、活化和细胞因子的分泌。在正常机体中,PD-1/PD-Ls信号通路对维持机体的免疫耐受具有重要作用;而在肿瘤发生时,PD-1/PD-Ls信号通路能抑制T细胞的免疫反应而促进肿瘤免疫逃逸的发生。本文从PD-1/PD-Ls的结构与表达、信号通路的作用机制、PD-1/PD-L1的可溶性分子(s PD-1/s PD-L1)的表达特性及其对PD-1/PD-Ls途径的作用等方面简述了PD-1/PD-Ls信号通路的研究现状,综述了抗PD-1/PD-Ls抗体及其在肿瘤免疫治疗中的临床应用。

PD-1/PD-L1信号通路及其抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展

肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要研究领域和突破点,细胞免疫方面,嵌合抗原受体(CAR)T细胞在治疗血液肿瘤的临床试验已取得实质突破,抗原特异性T细胞受体(TCR)基因转导T淋巴细胞在黑素瘤等肿瘤治疗中显示出巨大潜能;抗体应用方面,细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA4)抗体在2011年获得美国食品和药品监督管理局(FDA)批准。抗程序性死亡蛋白1(PD-1)抗体和抗PD-1配体(PD-L1)抗体则成为肿瘤免疫研究中新的热点,PD-1抑制剂Opdivo治疗晚期肺鳞状细胞癌和现行金标准多西他赛相比,持续显示生存期疗效优势,18个月总生存率是标准疗法的2倍。本文总结了PD-1/PD-L1信号通路及其抗体研究进展。