156例SARS患者血清抗SARS冠状病毒抗体的观测

本研究的目的是观察严重急性呼吸综合征 (severeacuterespiratorysyndrome ,SARS)患者抗SARS 冠状病毒 (SARS CoV)抗体IgG和IgM的产生及抗体效价变化特征 ,探索采集SARS痊愈患者抗血清的时机。应用ELISA方法对随机抽取的 156名SARS患者血清标本进行抗SARS CoV抗体IgG和IgM抗体效价测定。结果表明 ,156名SARS患者于病后 3至 9周期间 ,IgG抗体阳性率为 75.6% ,IgM抗体阳性率为 41.7% ,IgG和IgM抗体均阳性为 41% ,IgG和IgM抗体均阴性为 2 3 .7% ;IgG抗体阳性患者中抗体效价为 18.2 3± 2 4.72 ,IgM抗体阴性患者抗体效价为 2 .18± 1.13 ;IgG和IgM抗体效价与SARS患者的性别、年龄、病程、体温正常天数无显著相关性。结论 :并非所有SARS患者都能产生抗SARS CoV抗体 ,即使产生抗体 ,其效价的个体差异也较大 ,并不能通过性别、年龄、病程及体温正常天数等因素较准确地评估抗体的效价。因此 ,在SARS抗血清采集前 ,应重新进行抗体效价测定 ,遴选具有高效价抗SARS CoV抗体的SARS痊愈患者进行抗血清的采集 ,才能提高所采集的抗血清在临床的治疗效果 。

佛山地区重症SARS病例存在抗SARS冠状病毒抗体

目的:求证佛山地区首批临床诊断的SARS患者血清中是否存在抗SARS冠状病毒抗体。方法:以SARS冠状病毒全病毒裂解液作抗原,利用ELISA技术检测佛山地区首批出现急性呼吸窘迫综合征并具有明显传染特征的SARS康复患者和患者居住地“健康者”血清中抗SARS冠状病毒抗体。结果:4组有流行病学关系的19例SARS患者血清中抗SARS冠状病毒抗体全部阳性,而400名患者居住地的“健康者”血清中抗SARS冠状病毒抗体则全部阴性。结论:佛山地区首批SARS病例血清学调查结果发现在所有的患者血中均发现有抗SARS冠状病毒抗体,支持其病原体为SARS冠状病毒;抗SARS抗体IgG在SARS康复者血清中至少可存在6个月。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。

不同人群抗SARS冠状病毒特异性抗体血清学检测与分析

目的 :探索不同人群中抗SARS冠状病毒特异性抗体的发生、发展及分布规律 ;评价间接ELISA方法检测SARS冠状病毒IgG、IgM特异性抗体试剂盒及改进方法。 方法 :分别获取SARS流行前无偿献血者标本 3990份 ,一线抗SARS医务人员标本 397份和临床确诊的SARS患者标本 15 7份 ,采用ELISA方法进行SARS冠状病毒特异性抗体检测。结果 :SARS流行前无偿献血者标本 3990份共检出IgG抗体阳性标本 16份 ,阳性率为 0 .4 0 % ;IgM抗体阳性标本 0份 ,阳性率为 0 %。一线抗SARS医务人员标本 397份 ,共检出IgG抗体阳性标本 2份 ,阳性率为 0 .5 0 % ;IgM抗体均为阴性。临床确诊的SARS患者标本 15 7份 ,共检出IgG抗体阳性标本 119份 ,阳性率为 75 .79% ;IgM阳性标本 6 8份 ,阳性率为 4 3.31%。结论 :一线抗SARS医务人员与SARS流行前无偿献血者IgG、IgM抗体阳性率无显著差异 (P =0 .76 >0 .0 5 ) ;采用该SARS冠状病毒 (变异株 )IgG抗体试剂盒检测SARS流行前无偿献血者人群存在一定的阳性率 ,说明该试剂盒包被的抗原与其它免疫球蛋白 (IgG)有交叉反应 。

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoV N蛋白。结果肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞/巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoV N蛋白单克隆抗体均为阳性。结论SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoV N蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达,对研究SARS-CoV传播途径具有重要意义。

抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的： 制备抗SARS冠状病毒（SARS-CoV） M 蛋白N端1～43氨基酸（aa）单克隆抗体（mAb）, 并对其特性进行初步鉴定.方法： 用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb.用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株. Western blot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性, 并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAb Ig亚类.为分析mAb识别位点, 进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达, 以Western blot初步定位mAb识别位点.结果： 获得1株可分泌特异性抗SARS-CoV M蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株（3H9）, Ig亚类鉴定为IgG2a, 轻链为κ型.Western blot显示其mAb可特异识别SARS-CoV M蛋白N端1～43aa, 间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应, 其识别位点位于M蛋白N端16～28aa.结论： 成功获得1株抗SARS-CoV M蛋白N端1～43aa mAb杂交瘤细胞, 并初步定位其识别位点.

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白),并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体 (mAb)。方法: 采用RT- PCR方法, 从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因。测序确认后, 再亚克隆至原核表达载体中。从SDS -PAGE凝胶中回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 从标本中扩增出 1 269bp的DNA, 测序结果证实为N蛋白基因。将该基因克隆至原核表达载体中后, 在大肠杆菌中获得了较好的表达。表达产物经SDS- PAGE后, 在Mr约为 43 000处可见 1条明显的诱导表达带。Westernblot的结果表明, 该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应。从SDS- PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠, 制备出 3株抗N蛋白的mAb。这些mAb与SDS- PAGE凝胶上Mr约为 43 000的蛋白带也呈现很强的免疫反应。结论: 所获的重组N蛋白及特异性mAb, 将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础。

用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

SARS-CoVS蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。以单克隆抗体2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISAOD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoVS蛋白抗原与单抗2C5的结合。结果表明TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。

发热患者SARS冠状病毒抗体分析

目的了解临床发热患者中是否存在严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）隐性感染或亚临床感染。方法对2003年5月～7月，SARS流行期间湖北地区临床发热患者373例血清进行SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体（IgG、IgM、N蛋白抗体）酶联免疫吸附法（ELISA）检测和分子生物学（RT—PCR）检测。结果373例发热患者中，检出冠状病毒抗体阳性者24例，阳性率6．43％（24／373），其中SARSIgG抗体、IgM抗体、N蛋白抗体阳性率分别为0．54％，1．34％和5．09％，但SARS-CoVRT—PCR检测均为阴性。结论临床发热患者可能存在SARS-CoV隐性或亚临床感染，患者体内产生针对SARS-CoV的保护性抗体，应具有免疫力和抵抗力。

抗SARS冠状病毒表面抗原抗体的制备及其初步应用

研究探讨了制备和鉴定SARS 冠状病毒表面抗原的快速免疫检测方法。采用基因工程表达SARS冠状病毒表面抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,获得了4 株稳定分泌高特异性抗SARS冠状病毒表面抗原的杂交瘤细胞系,制取了含高效价单克隆抗体的腹水;采用SARS冠状病毒表面抗原免疫家兔、绵羊、山羊,制取了抗SARS冠状病毒表面抗原的多克隆抗体。研究结果表明:CS4 C11单抗作为示踪抗体、绵羊抗SARS冠状病毒表面抗原抗体作为固相抗体为最佳配对;CS4 C11 单抗作为示踪抗体、CS6B12单抗作为固相抗体次之。获得的抗SARS冠状病毒表面抗原的抗体为SARS的早期诊断研究奠定了基础。

SARS冠状病毒抗体工程的研究、应用及进展

SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体工程的研究建立了SARS的快速检测方法,深入探索了病毒的传播途径及致病机理。人源化抗体的研制及动物试验的成功使单克隆抗体用于SARS-CoV的预防及治疗成为可能。

SARS冠状病毒囊膜E蛋白的重组表达与单克隆抗体制备

从基因库中调取SARS冠状病毒囊膜E蛋白基因序列,用连接PCR方法合成完整片段。测序确认后与人免疫球蛋白(IgG)序列Fc段连接并克隆至原核表达载体pPROEXHta中。从SDS-PAGE凝胶中回收表达产物后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb)。连接PCR扩增出231bp的DNA,测序结果与GenBank公布的序列一致,与人IgG序列Fc段基因连接后克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中获得较好表达。表达产物经SDS-PAGE后,在相对分子质量(Mr)约37000处可见1条明显的诱导表达条带。Western印迹的结果表明,该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异性免疫反应。从SDS-PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠,制备出2株抗E蛋白的mAb。这些mAb与SDS-PAGE凝胶上Mr约为37000的蛋白带也呈现很强的免疫反应。所获得的重组表达E蛋白及特异性mAb为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础。

3种ELISA试剂对SARS冠状病毒血清抗体的检测分析

目的了解目前常用的SARS冠状病毒血清抗体酶联免疫吸附试验 (ELISA)诊断试剂对人和动物的检测结果。方法收集人类SARS接触者和动物血清标本 ,用2～3种ELISA试剂分别检测SARS冠状病毒血清抗体。结果华大试剂检测阳性率最高为4.41 % ,3种试剂各自独立实验间的相关系数在0.431～0.932之间 ,除万泰试剂和华大试剂的检测结果有相关性 (r=0.827)外 ,其余试剂间的结果均无相关性。结论不同试剂的抗体检出阳性率有部分差异 ,相同试剂两次检测结果具有相关性 。

SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)核壳(N)蛋白单克隆抗体,为寻求SARS早 期诊断的方法及深入研究SARS疾病提供有力的工具。 方法 以重组SARS CoVN蛋白免疫小鼠,采用甲基纤维 素半固体培养基法制备单克隆抗体。通过间接酶联免疫分析、间接免疫荧光、免疫双向扩散等方法鉴定抗体的特 异性、亲和力、类型及亚类、配对效果等。 结果 共获得15个阳性克隆,其中10个与天然SARS CoV呈阳性反应。 10株单抗的相对亲和常数在108～109mol L-1之间;10株中有1株为IgG2b、1株为IgG3,其余均为IgG1;10株单抗中 有8株与12种肺炎相关的病原体无交叉反应,1株与流感病毒A、B,副流感病毒有交叉反应,1株与流感病毒A、B 有交叉反应;10株单抗中的5株可形成5种配对,其中两种配对用于检测重组SARS病毒N蛋白,灵敏度可达1μg L。 结论 获得了特异性针对SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测SARS CoVN蛋白的酶联 双抗体夹心法,为SARS的早期诊断、蛋白质组学的研究奠定了基础。

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的:表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb)。方法:原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确。将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coliM15诱导表达His-S1m蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2。Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型。经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应。结论:成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。

系统性红斑狼疮患者检测SARS冠状病毒抗体阳性1例

目的 :报告 1例合并严重急性呼吸综合征 (SARS)冠状病毒抗体阳性的系统性红斑狼疮。方法 :根据病史、临床表现及实验室检查进行诊断。结果 :患者有不规则发热和面部蝶形红斑 ,关节痛 ,口腔溃疡 ,系统性红斑狼疮免疫抗体阳性 ,胸片提示狼疮肺样改变 ,SARS冠状病毒抗体阳性 ,排除SARS ,诊断系统性红斑狼疮。结论

SARS冠状病毒的抵抗力研究

目的了解SARS冠状病毒在体外环境中的存活规律,并研究氯和二氧化氯灭活SARS冠状病毒的效果,为切断SARS病毒的传播提供依据。方法采用SARS冠状病毒加标方法观察病毒在粪便、尿液及不同水体中的存活情况,采用次氯酸钠和二氧化氯消毒污水中的SARS冠状病毒,观察灭活病毒效果。结果加标的SARS冠状病毒在体外环境中的存活情况随温度而异,20℃避光条件下在医院污水、生活污水和脱氯自来水中只能存活2d,在粪便中可以存活3d,在生理盐水中可以存活14d,在尿液中可以存活17d;4℃情况下,SARS冠状病毒在上述各种水体中均可以存活14d以上,在粪尿中可以存活17d以上。SARS冠状病毒在污水中对消毒剂的抵抗力比大肠杆菌及f2噬菌体都低,在相同加氯量或余氯量情况下,氯制剂对SARS冠状病毒的灭活效果优于二氧化氯。当污水中游离余氯量保持在0.5mg/L(氯制剂)或2.19mg/L(二氧化氯)以上时可以保证完全灭活污水中的SARS冠状病毒,但对大肠杆菌和f2噬菌体则不能完全灭活。结论SARS冠状病毒在体外环境中存活时间短,对氯和二氧化氯敏感。

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学(IHC)检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示:通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生反应,特异性良好。本研究制备的PDCo V N蛋白单克隆抗体可为PDCo V诊断方法的建立以及N蛋白的功能研究奠定基础。