抗Siglec-9抗体Fab段对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应的作用研究

目的初步探讨抗Siglec-9抗体Fab段在小鼠巨噬细胞上对LPS诱导的炎症反应的作用及其机制。方法将小鼠巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+Ab组、Ab组,采用实时荧光定量PCR技术检测TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的mRNA水平;采用ELISA检测炎性细胞因子的蛋白水平;通过Western blot初步探讨抗Siglec-9抗体Fab段影响炎性细胞因子表达量的作用机制。结果与LPS组相比,抗Siglec-9抗体Fab段抑制炎性细胞因子的mRNA和蛋白水平,降低TLR4信号通路磷酸化水平。结论抗Siglec-9抗体Fab段通过阻断TLR4信号传导通路抑制炎性细胞因子的m RNA和蛋白水平,在感染性疾病中具有潜在的应用价值。

人源化抗Siglec-9抗体Fab片段的制备及鉴定

目的:构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重叠延伸PCR连接,酶切后与原核表达载体p ETDUET-1重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21中,通过蛋白纯化系统AKTA和His-trap Lambda Fab纯化。使用SDS-PAGE、ELISA以及Western blot鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR初步检测抗Siglec-9抗体Fab段对炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA检测证实抗Siglec-9抗体Fab段与Siglec-9抗原特异性结合。抗Siglec-9抗体Fab段可抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量。结论:人源化抗Siglec-9抗体Fab段进行了原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠定基础。

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ 抗体的轻链（Ｌ）和重链Ｆｄ 段基因，分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ 质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处有外源蛋白表达，表达蛋白含量分别为５３％ 和４８％ 。Ｌ链和Ｆｄ 包涵体蛋白经盐酸胍变性后，等量混合于折叠液中，Ｌ和Ｆｄ 可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。ＥＬＩＳＡ结果表明，复性蛋白具有与ＨＢｓＡｇ 结合的能力。抗ＨＢｓＡｇ 抗体Ｆａｂ 段在大肠杆菌中的表达与复性的成功，表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的。

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS

单克隆抗-D细胞株的建立及抗-D抗体Fab段的基因序列分析

目的 :建立分泌抗 -D抗体的人B淋巴细胞株 ,分析编码一株人单克隆抗 -D抗体Fab段的基因序列。方法 :以EB病毒 (EBV)转化分泌抗 -D抗体的人B淋巴细胞 ,建立分泌抗 -D抗体的淋巴细胞株。设计扩增人lgM重链Fd段及κ轻链的引物 ,以聚合酶链反应进行扩增 ,对扩增产物进行分子克隆及测序。结果 :分别用轻链引物和重链引物从一分泌lgM抗 -D的单克隆细胞株扩增出一约 650bp和 70 0bp的特异带。序列分析表明 ,其核苷酸及其所推导的氨基酸 (AA)序列符合人lgFab段的序列特征。结论 :获得了抗 -D抗体Fab段基因 ,为基因工程抗

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。

抗LPS mAb Fab片段cDNA的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法以逆转录PCR方法扩增抗LPSmAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-Teasy。经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC,并以PCR方法扩增pcD-NA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGHPoly(A)在内的轻链表达序列。经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3-Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcD-NA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞。经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Westernblot鉴定阳性克隆。结果用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株。Westernblot显示,表达产物的Mr为50000。同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LPS的活性。结论成功地在CHO细胞中表达抗LPSmAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础。

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。

自身免疫性胰腺炎合并原发性胆汁性肝硬化一例

患者男,65岁,因皮肤黄染伴尿色加深12d于2012年6月26日入院.体格检查：皮肤巩膜重度黄染,右上腹轻压痛,无反跳痛,肝脾肋下未触及.实验室检查：ALT 79 U/L,AST 51 U/L,碱性磷酸酶540 U/L,GGT 197 U/L,TBil393 μ mol/L,DBil 283.7 μ mol/L,免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）A 1 820 mg/L,IgG 31 800 mg/L,IgM 3 440 mg/L,IgG44.36 g/L,抗核抗体1∶320（核膜型十细胞质颗粒型）,抗线粒体抗体（＋）,抗线粒体M2抗体（＋）;肝炎病毒及血清CA19-9、CA125、AFP、CEA无异常.胰腺MRI示自身免疫性胰腺炎,胆总管下段狭窄（图1）.