抗VEGF发夹状核酶基因抑制VEGF表达及卵巢癌细胞增殖的实验研究

背景与目的:研究表明血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在与上皮性卵巢癌有关的血管形成过程中可能发挥着重要作用。目前,核酶策略已成为一种基因治疗的策略,用于阻断肿瘤形成或肿瘤的生长与转移。VEGF在卵巢肿瘤形成中的作用尚不十分清楚。我们试图采用抗VEGF发夹状核酶基因阻断卵巢癌中VEGF的自分泌和/或旁分泌通路,以检测其对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用G418筛选获得阳性克隆;RNA斑点杂交检测核酶基因在卵巢癌细胞中的表达;免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后卵巢癌细胞中VEGF表达;通过MTT、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:与SKOV3细胞相比,转染后的SKOV3-RZ细胞VEGF表达明显降低(P<0.01);细胞生长减慢,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低犤(12.7±1.4)%和(9.4±2.0)%比(30.1±1.9)%和(24.8±1.5)%,P<0.001犦;G1期细胞显著增多(77.6%比57.9%,P<0.01),S期细胞显著减少(17.0%比29.9%,P<0.01)。结论:抗VEGF发夹状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖;

抗VEGF发夹状核酶基因对人鼻咽癌细胞株VEGF表达及细胞增殖的影响

目的 探讨抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE—2的VEGF表达及其细胞增殖的影响。方法 采用脂质体介导法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染CNE-2细胞；RNA斑点杂交检测核酶基因在CNE-2细胞中的表达；免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后CNE-2细胞中VEGF表达；MTT法、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及流式细胞仪进行细胞周期分析，观察其对CNE-2细胞增殖的影响。结果 转染后的CNE—2细胞VEGF表达明显降低；细胞生长减慢，细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低；Go／G1期细胞显著增多，S期细胞显著减少（P〈0．01）。结论 抗VEGF发央状核酶基因可显著抑制CNE-2细胞的VEGF表达和ENE-2细胞增殖。

转染抗VEGF发夹状核酶基因白血病细胞模型的建立

目的建立转染抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因的白血病细胞模型,探讨发夹状核酶对白血病细胞系K562VEGF基因表达的效应。方法采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体(pcDNA3-RZ)转染入人白血病细胞系K562,G418抗性筛选获得阳性克隆,转染VEGFpcDNA3-RZ和空载体(pcDNA3)的细胞组均有抗性细胞生长,分别命名为K562-RZ和K562-PC;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转染入K562细胞,荧光定量PCR和westernblot方法分别检测白血病细胞VEGFmRNA和蛋白的表达量;同时测定K562-RZ,K562-PC和K562三组培养上清刺激内皮细胞生长的情况。结果抗VEGFpcDNA3-RZ成功转入白血病细胞系K562,G418筛选2周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562-PC细胞相比,转染VEGF核酶基因的K562-RZ细胞VEGFmRNA和蛋白的表达量明显降低;K562-RZ组培养上清对内皮细胞的刺激作用明显弱于K562-PC组。结论建立了转染VEGF发夹状核酶基因的白血病细胞模型,抗VEGF发夹状核酶基因可明显下调白血病细胞VEGF的表达,为抗肿瘤治疗提供了新的线索。

表达抗-VEGF发夹状核酶腺病毒载体的构建及其对结肠癌生长的抑制作用

背景与目的:VEGF过表达提示结肠癌预后不良。本实验构建带有抗-VEGF发夹状核酶的复制缺陷型腺病毒,观察其对结肠癌VEGF表达及肿瘤生长的抑制作用。方法:将人工合成的抗-VEGF发夹状核酶DNA定向克隆至转移质粒pAdTrack-CMV多克隆位点,然后与病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中重组,在293a细胞中包装成完整病毒(命名为Ad-Rz)并复制扩增、纯化。RT-PCR检测病毒感染后抗-VEGF发夹状核酶在HT-29细胞中的表达、real-time PCR及ELISA检测其对VEGF mRNA及蛋白表达的抑制作用。观察Ad-Rz对HT-29细胞和裸鼠移植瘤生长的抑制作用,CD34标记检测肿瘤组织微血管密度(MVD)。结果:抗-VEGF发夹状核酶成功克隆至复制缺陷型腺病毒载体上。抗-VEGF发夹状核酶可在HT-29细胞中表达,Ad-Rz感染的HT-29细胞中VEGFmRNA的相对表达量大约为PBS组的45%(P<0.05)。ELISA结果显示Ad-Rz感染后的细胞上清液中蛋白含量(A值)为0.455±0.35/百万细胞,低于PBS组(P<0.05)。Ad-Rz对HT-29细胞的生长抑制无统计学意义(P>0.05),但可显著抑制肿瘤组织内血管的形成(P<0.05),Ad-Rz治疗的移植瘤增殖率低于PBS组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:腺病毒载体介导的抗-VEGF发夹状核酶可有效抑制HT-29细胞VEGF的表达及移植瘤组织内血管的生成。

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制卵巢癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 :研究抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人卵巢癌细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的抑制作用 ,探讨卵巢癌基因治疗的新途径。方法 :人卵巢癌细胞SKOV3高表达VEGF ,将抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因真核表达载体 (pcDNA3 RZ)转染人卵巢癌细胞SKOV3,经G4 18筛选获得阳性细胞克隆 ,RNA斑点杂交检测核酶基因是否在细胞中表达。采用免疫组化、间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜荧光定量法及流式细胞仪结合间接免疫荧光检测转染前后细胞VEGF的表达情况。结果 :转染pcDNA3 RZ组细胞VEGF表达明显降低。结论 :抗人VEGF发夹状核酶基因真核表达载体可有效抑制卵巢癌细胞SKOV3中VEGF的表达 ,有望成为治疗卵巢癌的一种新方法。

抗HBV C区G_(11)饱和突变的发夹状核酶的体外制备

研究针对 HBV C区的 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶的体外制备 ,通过计算机设计针对 HBV C区的发夹状核酶 ,合成 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶基因片段 ,并把其克隆入自剪切核酶载体 p1.5的 3′- cis- Rz或 5′- cis- Rz之间。3 2 P标记 4种发夹状核酶的体外转录物 ,变性聚丙烯酰胺纯化回收获得 4种核酶。

抗血管内皮生长因子发卡状核酶基因抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖

目的 观察抗VEGF发卡状核酶基因对卵巢癌细胞增殖的影响。方法 采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗VEGF发卡状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌细胞 ,通过MTT、细胞贴壁克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。结果 转染后的SKOV3 RZ细胞生长减慢 ,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 (P <0 .0 0 1)。G1期细胞显著增多 (P <0 .0 1) ,S期细胞显著减少 (P <0 .0 1)。结论 抗VEGF发卡状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖 。

核酶在肿瘤基因治疗中的应用

核酶 (ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子 ,可特异性地与靶RNA序列结合并加以切割 ,人工设计合适的核酶可实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断 ,从而对疾病进行基因治疗。

血小板反应素基因、血管内皮生长因子蛋白表达和甲状腺乳头状癌转移之间关系的研究

抗肿瘤血管生成是近10年抗肿瘤发生、发展及其转移研究的热点。血管生成有赖于诱导和抑制血管生成的许多分子之间的局部平衡，血小板反应素（TSP）是最强的肿瘤血管生成负性调节分子之一。最近研究证明，TSP的表达水平不仅与恶性肿瘤的进展呈负相关，而且还能抑制内皮细胞的移行和新生血管的形成。我们采用逆转录多重聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测40例甲状腺乳头状癌（PTC）组织中TSP1和TSP2 mRNA的表达，同时采用免疫组化（SP）方法检测其血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况，分析TSP mRNA和VEGF在甲状腺乳头状癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系。

VEGF特异性核酶对Hela细胞VEGF表达的调节

目的 构建VEGF特异性发夹状核酶基因真核表达载体 ,观察其对Hela细胞VEGF表达的调节。方法 将核酶基因克隆入 pcDNA 3中 ,构建了抗VEGF发夹状核酶真核表达载体 pcDNA 3 -RZ ,并进行了核酶的体外切割活性检测。将该真核表达载体转染人宫颈癌Hela细胞 ,采用RNA斑点杂交、流式细胞仪免疫荧光及免疫细胞化学方法 ,检测Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平。结果 所构建的重组表达载体 pcDNA 3 -RZ正确 ,体外切割检测该核酶具有较高的切割活性。转染了 pcDNA 3 -RZ的Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平明显下降。 结论 成功地构建了抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体 。

慢性病毒性肝炎的基因治疗:核酶、反义寡核苷酸和显性负相突变

基因治疗已成为抗病毒治疗的一个主要的、潜在的应用领域。抗病毒策略可针对病毒生命周期的一个或数个阶段。病毒的生命周期包括:病毒对细胞膜的粘附、进人细胞内、脱衣壳、基因复制、表达、病毒装配以及最后病毒颗粒的释放。鉴于现行治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎病毒的疗效有限,研究了一些针对阻断病毒基因的表达或功能的抗病毒策略,如核酶、反义寡核苷酸和显性负相突变(Domi-

核酶研究进展

自从Cheh发现核酶以来,核酶的体外及细胞内应用取得了很大进展。人们已成功地设计、合成了核酶,并将其应用于抗病毒和抗肿瘤研究。现对国内外有关核酶的研究作一综述。

核酶技术的研究进展

核酶是一类具有酶活性的RNA分子。可序列特异性定点切割靶RNA,从而在分子水平和细胞水平真正实现了对失控基因或有害基因表达的有效阻断。本文对目前发现的几种核酶,特别是锤头状核酶及发夹状核酶的研究进展进行简要介绍。

“发夹”催化型RNA抑制HIV-1表达

北伊利诺伊斯大学(NIU)和加州大学圣迭戈校区(UCSD)的科学家发现,一种“发夹”状催化型 RNA 在人组织培养实验中能抑制 HIV-I 表达。NIU 的 Arnold Hampel 博士及其同事,以及 UCSD 的Flossie Wong-Staal 博士,发现这种发夹状核酶(ribozyme)能切割 RNA 基因拷贝,从而使

过氧化物酶体增殖物活化受体γ短发夹状核糖核酸抗肝癌增殖

过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome prolifera—tors activated receptorγ，PPART）在肝癌中过表达或处于较高的活性状态。RNA干扰能高效阻断目的基因表达，可作用于肿瘤发生、发展过程中基因异常高表达的环节。本研究构建靶向PPAR7基因的短发夹状RNA干扰表达载体（pshPPAR7），转染HCCLM3细胞，挑选阳性克隆构建裸鼠肝癌模型，观察PPAR7基因静默对肝癌生长的影响。

发夹状核酶研究进展

发夹状核酶是一种具有催化功能的 RNA,能够特异识别并切割底物。它的切割效率较高 ,对金属离子和 p H值变动的依赖较小。在抗病毒和抗疾病相关基因表达的基因治疗领域有很高应用前景。本文对它的结构、反应动力学。

短发夹状RNA对胃癌细胞株血管内皮生长因子mRNA表达的影响

RNA干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略，我们设计了针对血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA），观察其对人胃癌细胞血管VEGF表达的影响。

K562细胞VEGF基因表达下调后的基因表达谱改变

目的探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)基因VEGF表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染白血病细胞株K562、G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转入K562细胞;荧光定量PCR和免疫印迹反应检测白血病细胞中VEGFmRNA和蛋白表达量的改变;应用cDNA微阵列技术检测VEGF基因表达下调对白血病K562细胞株基因表达谱的影响。并用逆转录PCR验证PCNA、GSN基因的表达改变。结果抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转入白血病细胞株K562、G418筛选两周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562/PC细胞(转染空质粒的K562细胞)相比,转染VEGF核酶基因的K562/RZ细胞VEGFmRNA和蛋白的表达量明显降低,芯片中共有表达差异的基因191条,包括周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因,其中104条表达下调,87条表达上调。逆转录PCR证实GSN基因表达上调,PCNA基因表达下调。结论VEGF基因表达下调能引起白血病K562细胞株基因表达谱的改变,这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生了一定的影响。